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猪繁殖与呼吸综合征病毒激活NLRP3炎症小体的研究

来源：萌宠菠菠乐园时间：2025-02-27 09:12

【摘要】： 猪繁殖与呼吸障碍综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）是由PRRS病毒（PRRSV）引起猪的以繁殖障碍、呼吸道疾病、哺乳仔猪的高死亡率、免疫抑制和持续性感染为主要特征的传染病。最近研究证明，PRRSV感染肺泡巨噬细胞（PAM）后能够通过形成炎症小体（inflammasome）促进IL-1β的分泌。炎症小体是细胞内模式识别受体（PRRs）参与组装的一种大分子蛋白复合物，是天然免疫的重要组成部分。炎症小体能够识别病原相关分子模式（PAMPs）或者宿主来源的危险信号分子（DAMPs），激活促炎性蛋白酶caspase-1，活化的caspase-1切割IL-1β和IL-18的前体，产生相应的成熟细胞因子。研究PRRSV感染PAM后激活炎症小体的分子机理，对阐明PRRSV感染猪后引起炎症反应的机理具有重要意义，可以为PRRS的防控提供新的理论依据。本研究以PRRSV HuN4株感染PAM的cDNA为模板，扩增了编码核苷酸结合寡聚化域样受体蛋白含pyrin结构域3蛋白（NLRP3）、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）和caspase-1的基因片段，并以此为基础进行了PRRSV激活NLRP3炎症小体的研究，取得了以下结果：（1）根据GeneBank中提供的猪源NLRP3、ASC和caspase-1序列设计引物，以PRRSV HuN4株感染PAM的cDNA为模板扩增各目的基因片段，构建各基因的原核重组表达载体，诱导表达和纯化重组蛋白，用纯化的目的蛋白免疫Balb/c小鼠和新西兰大耳兔，制备了NLPR3、ASC和caspase-1的多克隆抗体和ASC的单克隆抗体，经蛋白免疫印迹和间接免疫荧光试验证实获得的抗体具有良好的特异性。（2）经过ELISA和Real-time PCR筛选确定PRRSV HuN4毒株作为研究毒株，Western bolt试验证明PRRSV HuN4能够激活pro-IL-1β和caspase-1并切割成活化形式；通过ELISA和Real-time PCR检测证明PRRSV HuN4能诱导IL-1β分泌且具有剂量依赖性。通过使用caspase-1抑制剂yVAD-CHO证明HuN4诱导IL-1β依赖于caspase-1的激活。将PRRSV HuN4感染的PAM细胞裂解液与ASC的兔源多抗共同孵育，进行免疫共沉淀实验，成功检测到NLPR3和caspase-1；利用siRNA干扰抑制NLPR3表达后，能够抑制IL-1β的转录和分泌；证明PRRSV HuN4感染PAM后能够激活NLRP3炎症小体。使用ATP依赖的K+-离子泵的抑制剂NH4Cl和溶酶体酸化系统抑制剂Glibenclamide能够抑制PRRSV激活的炎症小体的形成。（3）UV灭活的PRRSV HuN4处理细胞不能诱导IL-1β分泌，而转染PRRSV HuN4RNA能够诱导caspase-1切割活化和IL-1β的分泌，即能够诱导炎症小体的形成，且PRRSV RNA诱导IL-1β的分泌具有剂量依赖性。（4）利用ASC单克隆抗体与PRRSV HuN4感染的PAM裂解液共同孵育，通过IP-MS方法，获取了与NLRP3相互作用的宿主蛋白死亡盒子多肽19A（DDX19A），通过免疫共沉淀试验证明DDX19A通过Domain1结构域，NLRP3通过NOD结构域和LRR结构域参与二者的相互作用；激光共聚焦试验证实DDX19A和NLRP3在HKE293细胞中具有共定位，GST pulldown试验证明二者在体外具有相互作用。通过RNApulldown试验证明DDX19A能够结合PRRSV HuN4RNA，且DDX19A的Domain1结构域和Domain2结构域，PRRSV HuN4的5’UTR和3’UTR参与了二者的相互作用。本研究证明PRRSV感染PAM能够激活NLRP3炎症小体，并初步判断DDX19A参与了炎症小体的激活，对促进PRRSV的基础研究和临床研究都具有重要意义。

【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014

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