龟甲牡丹PEPC基因序列及其在基于KASP的龟甲牡丹鉴别中的应用的制作方法

本发明涉及分类鉴定学领域，特别是涉及分子鉴定方法领域，更为具体的说是涉及龟甲牡丹pepc基因序列及其在基于kasp的龟甲牡丹鉴别中的应用。

背景技术：

1、龟甲牡丹ariocarpus fissuratus属仙人掌科岩牡丹属，原产墨西哥。龟甲牡丹是岩牡丹属里面是爱好者最喜欢的一个品种，也是大家最熟悉的的一个品种，其生长速度很慢，被誉为“活着的石头”。在世界自然保护联盟(iucn)濒危物种红色名录中被评为“濒危”级别，同时被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(cites)附录ⅰ，除有国家机关证明为非商业进出口行为，禁止一切国际间的植株贸易。

2、目前对龟甲牡丹的鉴定以形态学为主。形态学鉴定需要有经验的专业鉴定人员，各海关口岸普遍缺乏形态鉴定专家；且龟甲牡丹和勃士牡丹在形态上比较相似，本属幼株形态上难以区别，因此急需要研究开发新的龟甲牡丹的鉴定方法，从而能够快速、准确鉴定龟甲牡丹，并降低对形态学专业鉴定人员的依赖性。

3、竞争性等位基因特异性pcr(kompetitive allele-specific pcr，kasp)技术是近些年来发展起来的一种主要基于snp的高通量基因分型技术。kasp技术既有准确度，又降低了成本，更具snp位点适用性，在物种鉴定上有很好的应用潜力。

4、应用kasp技术的核心是寻找准确的snp位点，snp是单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism，snp)的缩写，是一种普遍分布在植物基因组中，被广泛应用于性状基因的精细定位和分子辅助育种等领域的标记位点。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种新的准确、快速鉴定龟甲牡丹的方法，特别是一种龟甲牡丹的生物学鉴定方法，从而降低形态学鉴定方法对专业鉴定人员的依赖性。

2、为了解决上述技术问题，本发明公开了龟甲牡丹pepc基因序列，所述pepc基因序列如seq id no:1所示。

3、进一步地，本发明还公开了所述龟甲牡丹pepc基因序列在鉴别或辅助鉴别黑牡丹中的应用。

4、同时，在本发明中还公开了一种检测龟甲牡丹pepc基因序列中的snp位点的物质在鉴别或辅助鉴别黑牡丹中的应用，并限定所述snp位点为pepc基因序列中第152号核酸位点，其碱基为g。

5、进一步地，上述物质为如seq id no:2所示的正向引物pcc-a-fis-f1-1、如seq idno:3所示的正向引物pcc-a-fis-f1-2以及如seq id no:4所述的反向引物pcc-a-fis-r1组成的引物组合。

6、在本发明中还公开了一种试剂盒，所述试剂盒包含如seq id no:2所示的正向引物pcc-a-fis-f1-1、如seq id no:3所示的正向引物pcc-a-fis-f1-2以及如seq id no:4所述的反向引物pcc-a-fis-r1。

7、并进一步公开了上述试剂盒在鉴别或辅助鉴别黑牡丹中的应用。

8、最后，在本发明中还公开了一种鉴别或辅助鉴别龟甲牡丹的方法，包括如下步骤：对待检测样品基因dna进行pcr扩增，得到待检测pcr扩增产物；然后对pcr扩增产物进行kasp反应，并根据基因分型结果，确定其是否为龟甲牡丹。当样品结果靠近横轴，则结果为阳性，表明样品种类为龟甲牡丹(ariocarpus fissuratus)；当结果没有出现明显的基因分型簇，检测结果均在纵轴，则结果是阴性，表明样品中不是龟甲牡丹(ariocarpusfissuratus)。

9、并且，进一步在本发明中还公开所述kasp反应中，采用核苷酸序列如seq id no:2所示的正向引物pcc-a-fis-f1-1、如seq id no:3所示的正向引物

10、pcc-a-fis-f1-2以及如seq id no:4所述的反向引物pcc-a-fis-r1组成的引物组合。

11、进一步地，所述如seq id no:2所示的正向引物pcc-a-fis-f1-1的5′端加上gaaggtgaccaagttcatgct接头序列、如seq id no:3所示的正向引物pcc-a-fis-f1-2的5’端加上gaaggtcggagtcaacggatt接头序列。

12、本发明中公开的龟甲牡丹pepc基因尚未报道过，本发明的发明人以该pepc基因为基础，获得具有鉴定龟甲牡丹的特异性snp位点。从而能够利用kasp基因分型技术，通过设计kasp特异性引物，准确鉴定龟甲牡丹。

技术特征：

1.龟甲牡丹pepc基因序列，其特征在于：所述pepc基因序列如seq id no:1所示。

2.权利要求1所述的龟甲牡丹pepc基因序列在鉴别或辅助鉴别龟甲牡丹中的应用。

3.一种检测龟甲牡丹中pepc基因序列中的snp位点的物质在鉴别或辅助鉴别龟甲牡丹中的应用，其特征在于，所述snp位点为pepc基因序列中第152号核酸位点，其碱基为g。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述物质为如seq id no:2所示的正向引物pcc-a-fis-f1-1、如seq id no:3所示的正向引物pcc-a-fis-f1-2以及如seq id no:4所述的反向引物pcc-a-fis-r1组成的引物组合。

5.一种试剂盒，所述试剂盒包含如seq id no:2所示的正向引物pcc-a-fis-f1-1、如seq id no:3所示的正向引物pcc-a-fis-f1-2以及如seq id no:4所述的反向引物pcc-a-fis-r1。

6.权利要求5所述的试剂盒在鉴别或辅助鉴别黑牡丹中的应用。

7.一种鉴别或辅助鉴别龟甲牡丹的方法，包括如下步骤：对待检测样品基因dna进行pcr扩增，得到待检测pcr扩增产物；然后对pcr扩增产物进行kasp反应，并根据基因分型结果，确定其是否为龟甲牡丹。

8.根据权利要求7所述的鉴别或辅助鉴别龟甲牡丹的方法，其特征在于：所述pcr扩增采用核苷酸序列如seq id no:2所示的正向引物pcc-a-fis-f1-1、如seq id no:3所示的正向引物pcc-a-fis-f1-2以及如seq id no:4所述的反向引物pcc-a-fis-r1组成的引物组合。

9.根据权利要求7所述的鉴别或辅助鉴别黑牡丹的方法，其特征在于：所述如seq idno:2所示的正向引物pcc-a-fis-f1-1的5′端加上gaaggtgaccaagttcatgct接头序列、如seqid no:3所示的正向引物pcc-a-fis-f1-2的5’端加上gaaggtcggagtcaacggatt接头序列。

技术总结
本发明涉及分类鉴定学领域，特别是涉及分子鉴定方法领域，更为具体的说是涉及龟甲PEPC基因序列及其在基于KASP的龟甲牡丹鉴别中的应用。本发明中公开的龟甲牡丹PEPC基因尚未报道过，本发明的发明人以该PEPC基因为基础，获得具有鉴定龟甲牡丹的特异性SNP位点。从而能够利用KASP基因分型技术，通过设计KASP特异性引物，准确鉴定龟甲牡丹。

技术研发人员：李井干,吴晶,余本渊,许忠祥,伏见国,杨晓军,李洋,郭静,刘晓宇,杨静
受保护的技术使用者：南京海关动植物与食品检测中心
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13

相关知识

龟甲及其类似品鉴别
龟甲的真假鉴别 三招为你答疑解惑
龟甲(龟板)的真伪鉴别
龟甲的用法
醋龟甲的功效与作用 龟甲对卵巢的作用
如何制作龟甲标本？
如何制作龟甲标本
龟甲如何保养 龟甲日常正确保养方法及禁忌讲究
龟甲的烹饪方法
龟甲的炮制方法

网址: 龟甲牡丹PEPC基因序列及其在基于KASP的龟甲牡丹鉴别中的应用的制作方法 https://www.mcbbbk.com/newsview1066825.html