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抗氧化剂组合物和陪伴动物的方法.pdf

来源：萌宠菠菠乐园时间：2024-09-19 11:35

游离基是活有机体的有氧代谢中固有的并且通常随生理和病理过程产生。它们有时有意地产生，从而起生物功能作用，例如吞噬细胞中的杀微生物剂，或者它们可能为化学变化，之后呈现破坏性行为。无论它们的产生机理如何，如果游离基的产生和除去得不到控制，那么它们对有机体的影响可能为破坏性的。为了对抗过度且不适宜的破坏，开发出了一种精细的抗氧化剂防御系统。

当有利于氧化剂的氧化剂与抗氧化剂之间失衡时，存在氧化应力症状，它可能导致组织损伤。

本发明尤其提供了一种克服家庭猫和狗中氧化应力问题的方法。

因此，本发明的第一个方面提供了一种增加家养猫或狗中血浆维生素 E水平的方法，该方法包括步骤：向所述猫或狗给予维生素E，其量足以增加血浆维生素E水平。该增加可以是在该动物血浆中可以测定的最大/ 饱和点。该增加可以为该动物自身的血浆维生素E水平基线的2-3倍(大约最大生理增加)。当与给动物喂食对照饮食时的血浆维生素E水平比较时，该增加可以使单个动物的血浆维生素E水平增加高至25％，优选25％或以上(优选高至50％，或25-50％，或者甚至50-90％)。对照饮食例如是猫或狗的总维生素E消耗为10 IU/400kcal。

维生素E为几种具有相同生物活性的生物学上类似的化合物的共同术语，包括称作生育酚类和生育三烯酚类的那些。动物组织中生物学活性最大的维生素E的生物形式(也为活性最大的抗氧化剂)为α-生育酚。维生素E不能在体内合成。维生素E防止细胞膜失去完整性，细胞膜完整性的丧失有害地改变细胞和细胞器功能。

维生素E的单位可以国际单位(IU)表示，其中1 IUα-生育酚等于1mg α-生育酚。其它维生素E化合物具有通过其与α-生育酚比较的生物潜能测定的IU，如McDowell，L.R(1989)Vitamin E：In vitamins in Animal Nutrition，Chapter 4，page 96，Academic Press，UK中所述。

时至今日，足够防止家庭狗或猫中呈现维生素E缺乏症状的最小维生素E水平之上和之下的维生素E水平还未引起注意。本发明认为，狗或猫中维生素E的水平反映了它们饮食中的水平，并且这些水平提供了动物以预制宠物食品为食时没有超过的典型基线水平(参见实施例)。本发明显示了可以通过在动物饮食中加入较高水平的维生素E(并且这可以通过提供特定预制的宠物食品和/或者猫或狗补充物来实现)来增加狗和猫中的维生素E水平。

本发明的一个方面提供一种降低家庭猫和狗中氧化应力的方法。氧化应力的这种降低，特别增强了免疫反应，并提供了更健康的动物。狗或猫中氧化性损伤的标记物尤其包括：血浆羰基(蛋白质氧化的终产物)、血浆脂质过氧化氢(脂质氧化的标记物)和响应LDL氧化产生的抗-LDL抗体。任意这些降低都将显示氧化性损伤减少。

按照本发明第一个方面的维生素E可以为任意形式。它可以为生育酚或生育三烯酚。它可以为α-生育酚(d-α或dl-α)、β-生育酚(d-β或dl- β)、γ-生育酚(d-γ或dl-γ)、δ-生育酚、α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、 γ-生育三烯酚或δ-生育三烯酚。优选α-生育酚。

维生素E的来源没有限制。优选的维生素E源包括醋酸维生素E(例如醋酸生育酚)、醋酸维生素E吸附物或经喷雾干燥的醋酸维生素E。尽管可以使用天然的来源，但是优选来源为合成的。

维生素E的给予形式没有限制。可以为饮食、食品或补充物的形式。本文下面的术语“食品”包括所有食品、饮食和补充物。任意这些形式可以为固体、半固体或液体。

该补充物对未含足够高的一种或多种本发明组分的饮食或食品特别有用。这些组分在补充物中的浓度可以用于“增加至”动物饮食或食品中的水平。这可以通过在动物饮食中包含大量该补充物或者通过另外向动物喂食大量该补充物进行。补充物可以形成为具有极高量一种或多种本发明组分的食品，该组分在喂食动物之前需要稀释。补充物可以为任意形式，包括固体(例如粉末)、半固体(例如食品样稠度/凝胶)、液体或者，它可以为片剂或胶囊形式。液体可以方便地与食品混合或者直接喂给动物，例如经过匙或经过吸管样装置。该补充物可以为高含量的一种或几种本发明组分或者可以为至少两部分的组合包装，每一部分含有所需量的一种或多种组分。

优选将该维生素E加入商品化宠物食品或商品化饮食补充物中。宠物食品可以为干燥、半干燥、润湿或液体(饮料)产品。润湿产品包括在锡或箔容器中销售并具有70-90％水分含量的食品。干燥产品包括具有相似组成的食品，但具有5-15％水分和以饼干样粗粒出现。优选将该饮食、食品或补充物包装。以这种方式，消费者可以从包装上了解到食品中的组分并考虑它是否适合狗或猫。该包装可以为金属(通常为锡或柔性箔)、塑料、纸或卡片。任何产品中的水分含量都有可能影响使用或所需的包装类型。

本发明的食品包括狗或猫饮食消费的任何产品。因此，本发明包括标准食品产品，还包括宠物食品小吃(例如小吃棒、饼干和甜食)。食品优选煮制产品。可以加入肉或得自动物的物料(例如牛肉、鸡肉、火鸡肉、羊肉、血浆、髓骨等，或其两种或多种)。为了提供蛋白源，该食品或者可以没有肉(优选含有肉代用品如大豆、玉米谷蛋白或大豆产品)。产品可以含有其它蛋白源如大豆蛋白浓缩物、乳蛋白、谷蛋白等。该产品还可以含有如一种或多种谷物的淀粉源(例如小米、玉米、大米、燕麦、大麦等)或者可以没有淀粉。典型的干燥商品化狗和猫食品含有约30％粗蛋白、约10-20％脂肪，其余为碳水化合物，包括膳食纤维和灰分。典型地的润湿、或含水产品含有(以干物质计)约40％脂肪、50％蛋白质且其余为纤维和灰分。本发明特别涉及猫或狗的食品或补充物，其为固体。

本文中的术语“家庭”狗和“家庭”猫意指狗和猫，特别是Felis domesticus和Canis domesticus。

可以容易地测定狗或猫中血浆维生素E的水平。测定血浆维生素E水平的代表性例子描述在实施例的引言部分。

可以容易地测定产品(固体或液体或任意其它形式)中维生素E的浓度。这也描述在实施例的引言部分中。

在本发明的第一个方面，对照饮食可以向动物提供15 IU/400kcal的总维生素E。

按照本发明第一个方面的维生素的给予量优选为25 IU/400kcal饮食。在全文中，浓度/kcal是指kcal总代谢的能量摄取。可以使用如下文献中所述确定卡密度：Nutritional Requirements of Dogs(1985) National Research Council(U.S.)National Academy Press Washington DC，ISBN：0-309-03496-5或Nutritional Requirements of Cats(1986)National Research Council(U.S.)National Academy Press Washington DC，ISBN：0-30903682-8。猫的优选水平为30 IU/400kcal、35IU/400kcal、40IU/400koal、45IU/400kcal、50 IU/400kcal、55IU/400kcal，到高至约100 IU/400kcal或之上。狗的优选水平为30IU/400kcal、40IU/400koal、45IU/400kcal、50 IU/400kcal、55IU/400kcal、60IU/400kcal、65IU/400kcal到高达约100IU/400kcal或更高。

就本发明的第一个方面而言，该方法可以包括给予一定量的维生素 C(抗坏血酸)。

维生素C是水溶性物质。在家庭猫和家庭狗中它都是经重新合成的。由于它是在体内合成的，以前从未调查过狗和猫中的维生素C补充物的影响。特别是从未调查过猫和狗中的维生素C补充物作为潜在抗氧化剂与维生素E补充物组合时的影响。

本发明显示了通过补充可以增加猫和狗中维生素C的水平。这可以通过补充维生素C之后血浆值增加来证实。维生素C增加可以有利于减少游离基，因此降低了动物中的氧化应力。

根据本发明第一个方面的维生素C可以为任意形式。它可以为液体、半固体或固体。优选它为热稳定形式，例如磷酸钙形式。

维生素C的来源没有限制。优选的维生素C源包括结晶抗坏血酸(任选纯的)、涂布乙基纤维素的抗坏血酸、抗坏血酸的磷酸钙盐、抗坏血酸-2- 一磷酸盐或抗坏血酰基-2-单磷酸盐，还有少量二磷酸盐和痕量三磷酸盐、磷酸钙，或者例如鲜肝。

可以容易地测定产品(固体、液体或任意其它形式)中维生素C的水平。这描述在本实施例的引言部分中。

关于与维生素C组合使用维生素E的其它有用的观点为其协同作用的潜能。这借助于维生素E为脂溶性而维生素C为水溶性的事实。已知α- 生育酚位于脂质体膜中。抗坏血酸盐和α-生育酚例如在细胞膜或脂蛋白与水之间的界面相互作用。抗坏血酸快速减少膜中的α-生育酚游离基，从而再生α-生育酚。与动物喂食对照饮食时相比，按照本发明第一个方面的维生素C的优选浓度为优选使动物的维生素C水平增加高至约25％(优选25％或更多)的水平，这样(猫或狗)的维生素C消耗的总量为 5mg/400kcal饮食。没有达到该增加的维生素C水平仍然被本发明的第一个方面覆盖。按照本发明第一个方面的维生素C的水平包括从10、12、15、 17、20、22、25、27、30、32、38、40、42、48至高达约50mg/400kcal 饮食。猫的优选水平为10-48mg/400kcal的上面选项，狗的优选水平为 12-50mg/400kcal的上面选项。55mg/400kcal以上的水平并未赋予增加的益处，并且通常最好避免。

本发明的第一个方面包括给予一定量的牛磺酸。牛磺酸可以为除上述的补充维生素C之外的，或者代替上述的维生素C。

牛磺酸是在各种动物种中发现的不常见的氨基酸。牛磺酸为猫的必需营养素，与狗不同，猫不能由前体氨基酸合成牛磺酸。人们认为牛磺酸保护细胞膜免遭包括氧化剂的毒性组分。动物饮食中维生素牛磺酸水平增加可以有利于减少游离基，因此降低了动物中的氧化应力，特别是其与本发明的其它组分组合时。

按照本发明第一个方面的牛磺酸可以为任意形式。它可以为粉状、结晶、半固体或液体。

牛磺酸的来源没有限制。优选的牛磺酸来源包括氨基乙基磺酸 (C2H7NO3S)。这些来源可以为天然或合成的。

通常产品的加工方法(例如产品是否干燥或罐装)决定了按照本发明的第一个方面给予的牛磺酸的适宜浓度。为了将猫中血浆牛磺酸水平保持在正常范围(＞60μmol/l)，罐装(湿)饮食每天必需补充至少39mg牛磺酸 /kg体重，并且干燥饮食每天补充至少19mg/kg体重。就未经过高温法(例如罐装)的产品而言，本发明的第一个方面提供的优选水平为约 80mg/400kcal饮食，以mg/400kcal饮食计的更优选约100，渐增更优选 120、150、180、200、220、250、280、300、320、350、400和以上。在例如通过高温加工的产品中，按照本发明的水平优选约380mg/400kcal 饮食，以mg/400kcal饮食计的更优选约400，渐增更优选420、450、480、 500、520、550、580、600、620、650、700和以上。

可以容易地测定产品(固体、液体或任意其它形式)的牛磺酸浓度。代表性方法描述在实施例的引言部分中。通过膳食补充可以强化牛磺酸在猫体内的状态。通过血浆水平可以测定膳食牛磺酸含量的剂量响应效果。这也描述在实施例的引言部分中。

本发明的第一个方面还可以包括给予一定量的类胡萝卜素。该类胡萝卜素可以为除上面所述的补充维生素C和/或牛磺酸之外的，或者是代替这两者。

类胡萝卜素为一组主要在植物食品，特别是水果和蔬菜，以及以植物为食的动物组织中发现的红色、橙色和黄色颜料。它们为亲脂化合物。一些类胡萝卜素起维生素A前体的作用，一些则不能。该性能与其抗氧化剂活性无关。类胡萝卜素可以起强抗氧化剂的作用。类胡萝卜素以不同程度被不同动物种吸收。类胡萝卜素可以分成两大类：以胡萝卜素为基础的那些和以叶黄素为基础的那些(包括氧化化合物)。普通的类胡萝卜素包括：β-胡萝卜素、α-胡萝卜素、番茄红素、黄体素、玉米黄质和虾青素。未证实类胡萝卜素为猫或狗膳食中的主要营养素。与人和狗不同，猫不能将前体β-胡萝卜素转化成活性维生素A形式，这是由于在猫的肠粘膜中缺少该转化所需的酶(猫没有裂解胡萝卜素分子所需的二氧化酶。

本发明显示了类胡萝卜素可以被家庭猫和狗吸收(从而使血浆浓度增加) 并且可有利于降低氧化应力。而且，本发明已证实，类胡萝卜素在加入商业化产品之后可以被吸收。如上所述，本发明第一个方面的组分可以协同作用。维生素E能够防止β-胡萝卜素氧化，可以具有保护β-胡萝卜素的效果。维生素E被认为可防止β-胡萝卜素的化学键被氧化。

对类胡萝卜素的来源没有限制，可以包括天然和合成源。特别优选的来源为天然源并包括：金盏菊粗粉和苜蓿粗粉(黄体素源)；番茄粗粉、红色棕榈油、番茄粉、番茄渣/浆(β-胡萝卜素和番茄红素的来源)。来源包括类胡萝卜素水平高的油和经过纯加工的类胡萝卜素如黄体素、三色堇黄质、隐黄质、红木素、玉米黄质、阿朴-EE(阿朴-8-胡萝卜酸乙酯)、鸡油菌黄质、citranaxanthin，achinenone，番茄红素和辣椒黄素。类胡萝卜素的优选总量为0.01mg/400kcal、或0.2mg/400kcal或1mg/400kcal 或2mg/400kcal。

以下类胡萝卜素的浓度优选：

β-胡萝卜素：0.01-1.5mg/400kcal，优选0.5-1mg/400kcal

番茄红素：0.01-1.5mg/400kcal，优选0.5-1mg/400kcal

黄体素：0.05-1.5mg/400kcal，优选0.5-1mg/400kcal。

特别地，本发明在本发明的第一个方面提供了类胡萝卜素的组合。

组合的类胡萝卜素的优选来源包括：

红色棕榈油和金盏菊粗粉

番茄粉末、金盏菊粗粉和苜蓿

番茄渣和金盏菊粗粉。

如上所述，本发明包括维生素E和任选其它组分。有用的组分组合(优选在罐装或干燥宠物食品中)包括：

维生素E、维生素C、牛磺酸、红色棕榈油和金盏菊粗粉

维生素E、维生素C、牛磺酸、番茄粉、金盏菊粗粉和苜蓿

维生素E、维生素C、牛磺酸、番茄粉和金盏菊粗粉

维生素E、维生素C、牛磺酸、番茄粉和苜蓿

维生素E、牛磺酸、番茄粉和金盏菊粗粉。

本发明的组合为：

生产(干燥产品)之后的大约活性组分

mg/400kcal 维生素C 20mg抗坏血酸维生素E 50 IU 牛磺酸 200mg(在湿产品中为500mg) 黄体素 0.17mg 番茄红素 0.03mg β-胡萝卜素 0.01mg

本发明的另一有用组合为：

维生素E 50IU/400kcal

维生素C 20mg/400kcal

牛磺酸 500mg/400kcal

β-胡萝卜素 0.5-1mg/400kcal

番茄红素 1mg/400kcal

黄体素 0.5-1mg/400kcal

本发明食品中的其它有用组分包括：痕量的矿物质(非直接抗氧化剂，单在抗氧化剂金属酶系统中起辅因子的作用)、硒(抗氧化剂硒合酶、谷胱甘肽氧化酶的必要部分)、铜、锌和锰(形成整体部分抗氧化剂金属酶 Cu-Zn-超氧化物歧化酶和Mn-超氧化物歧化酶)。

按照本发明第一个方面的方法，这些组分可以同时、单独或相继地给予或消费。

按照本发明第二个方面，提供了一种狗或猫的食品，其递送浓度足够的成分给动物以增加动物的抗氧化状态。

本发明第一个方面的所有优选特征也可用于第二个方面。特别是第一个方面的所有水平和优选水平(包括更优选和最优选水平)在第二个方面中也具有。

该狗或猫食品优选提供大于20mg/l维生素E的抗氧化剂状态。

本发明的第三个方面提供了狗或猫食品，它提供了浓度为本发明第一个方面的水平的维生素E。该浓度可以为提供所述百分比增加或特定(包括优选)水平的本发明第一个方面中所述的。

该第三个方面的狗或猫食品还可以提供浓度也为本发明第一个方面的维生素C水平的的维生素C。

该第三个方面的狗或猫食品除维生素C之外或作为替代可以提供浓度也为本发明第一个方面中牛磺酸水平的牛磺酸。

该第三个方面的狗或猫食品除维生素C和/或牛磺酸之外或作为替代可以提供浓度也为本发明第一个方面中类胡萝卜素水平的类胡萝卜素。

该第三个方面也具有第一和二方面的优选特征。

本发明的第四个方面是将本发明第三个方面的狗或猫食品用于预防或治疗狗或猫的低抗氧化状态。

该第四个方面也具有第一至三个方面的优选特征。

本发明的第五个方面是将按照本发明第二、三、四或九个方面的狗或猫食品用于预防或治疗具有氧化应力成分的任意紊乱。该用途分别用于预防或治疗作为“疾病”或“紊乱”组成的氧化应力(因此通过减轻氧化应力组成(至少至一定程度)可以减轻疾病或紊乱)。这些紊乱包括：老化、癌症、心脏疾病、动脉粥样硬化、关节炎、白内障、炎性肠道病、肾疾病、肾衰竭、神经变性疾病和免疫性(例如损伤的免疫性)。还包括预防和治疗因动物接种(经常一年一次)和麻醉剂引起的氧化应力，它还可以用于常年治疗如牙治疗(可能需要常规麻醉剂)和与紫外光或射线接触。就免疫功能而言，这同样可用于因年龄(例如成长的动物或衰老的动物) 以及经受免疫攻击的那些而具有损伤的免疫功能的那些对象。在临床上健康的动物中保持健康的免疫反应(以及使免疫反应最佳或提高免疫反应) 也包括在该定义中。

在现有技术中对脊椎动物的免疫系统的讨论已有很多(例如Roitt、 Brostaff和Male的"Immunology"，Gower Medical Publishing，London， New York，1985)。免疫攻击包括感染、接种和其它外部因素如麻醉(例如在手术之前)。本发明的目的是提供一种可用于保持、最佳化或“提高” 免疫系统的饮食/食品或补充物(和相关方面)，以便在免疫攻击时赋予提高的免疫反应。可以通过测定响应给定抗原产生的抗体来监控免疫反应。这些知识和技术为本领域的标准知识和技术。提高的免疫反应抗原通过在给定时间框架内循环抗体的较高水平(滴度)、较快检测到的抗体反应或将循环抗体滴度保持较长时间来表示。

在免疫攻击期间，提高的免疫反应对动物有帮助，并且抗原特定地用于年轻动物，这是由于年轻动物不可能具有发育完全的免疫系统。由于经常对年轻动物进行预防接种，因此本发明提供了一种接种时可以通过动物赋予提高的免疫反应的方式。本发明特别用于在接种瘟热、细小病毒和/或腺病毒疫苗抗原之前喂食狗。本发明特别用于向猫喂食抗猫泛白细胞减少症、猫杯状病毒和/或猫疱疹病毒的疫苗或组合疫苗时给予。在免疫攻击之前喂食的适宜时间长度取决于正在讨论的动物和该免疫攻击。可以一致地喂食食品。在免疫攻击之前的8、6、4、2和1周是适宜的。更长时间也是适宜的。

本发明还提供了预防或治疗氧化应力部分或具有氧化应力部分的紊乱的方法，所述方法包括向所述狗或猫喂食本发明的食品。这些紊乱如上所述。本发明还涉及在狗或猫中强化免疫攻击的免疫反应的方法，所述方法包括喂食本发明的食品。

该第五个方面也具有1-4方面的优选特征。

第六个方面提供了维生素E在生产用于预防或治疗具有氧化应力成分的任意猫或狗紊乱、或者用于预防或治疗氧化应力的药物/临床或兽医饮食中的用途。

该第六个方面也具有1-5个方面的优选特征。

本发明的第7个方面提供了维生素E以25 IU/400kcal或以上的量加入作为狗或猫中体内抗氧化剂的食品中的用途。1-6个方面的所有优选特征在第七个方面也具有。特别是维生素E的量可以与本发明第一个方面设定的维生素E的优选量相同。

本发明的第八个方面提供了一种制备本发明第2-5个方面任意的食品的方法，该方法包括将至少两种食品组分混合在一起。这些组分之一为所需量的维生素E。食品的优选形式为宠物食品产品，因此任意形式的该宠物食品产品的制备方法包括：将用于宠物食品的组分混合在一起并加入本发明的一种或多种组分。这些组分可以在生产/加工食品的任意时间加入，包括在结束时，包装前的最后步骤。

可以按照本领域已知的任意方法制备该产品，例如在Waltham Book of Dog and Cat Nutrition，ATB Edney编辑，Chapter by A.Rainbird， entitled"A Balanced Diet"，pages 57 to 74，Pergamon Press。

本发明的第九个方面提供了一种含有浓度为15mg/400kcal饮食的维生素C的狗或猫食品。该饮食、食品或补充物细节与本发明前面方面中涉及维生素C组分所述的那些相同，它含有浓度为15mg/400kcal饮食的维生素C。正如本文所述，1-8个方面的特征可以是单独的或者任选与本发明第九个方面的浓度的维生素C组合在一起。本发明的第九个方面提供了一种用于预防或治疗具有氧化应力成分的紊乱的食品。这些紊乱也与本发明前面方面中所述的相同。在狗或猫食品中含有维生素C仍至涉及所述的维生素C浓度是独一无二的，并且特别是或所给的用途。

维生素C浓度范围为15mg/400kcal以上。优选含量为如本发明第一个方面显示的维生素C优选浓度的在15mg/400kcal以上的那些。由于维生素C在家庭猫和家庭狗中都可以合成，因此从未考虑经过猫或狗食品向猫或狗引入补充量的维生素C特别感兴趣。然而，本发明显示了这种饮食可以特别用于主要生产临床饮食/兽医饮食/药物。

本发明还提供了维生素C在狗或猫食品中的用途。该用途可以为生产预防或治疗具有氧化应力成分的紊乱或用于预防或治疗氧化应力成分的饮食。这些紊乱包括癌症、老化、心脏病、动脉粥样硬化关节炎、白内障、炎性肠病、肾病、肾衰竭、神经变性病或损伤性免疫力，例如遭受感染的动物。本发明还可用于治疗或有助于健康动物的免疫攻击。

本发明还涉及一种预防或治疗狗或猫中具有氧化应力成分的紊乱(或者氧化应力成分)的方法，包括向所述猫或狗喂食本发明第九个方面的食品。

在实施例部分中参照了以下附图：

图1显示了通过补充50 IU/400kcal和100 IU/400kcal维生素E狗中的维生素E血浆状态的增加。

图2显示了反映膳食维生素C补充之后的猫中维生素C血浆状态。

图3显示了补充膳食维生素E之后猫中的维生素E血浆状态。

图4和5显示了接种之后使用补充和未补充的饮食的抗细小病毒抗体滴度的水平。

图6显示了接种之后使用补充和未补充的饮食的抗瘟热疫苗反应。

图7显示了补充抗氧化合剂的狗中抗腺病毒抗体的保持性。

图8显示了持续喂食8周抗氧化剂饮食的狗中的FRAP测定。

图9显示了持续喂食8周抗氧化剂的狗中血浆维生素E水平。

现在参照以下非限制性实施例描述本发明。本领域技术人员应意识到，特别是按照本文引证的各种参考文献的教导，可以对这些实施例实施的本发明进行各种改变，将这些参考文献的内容加入本文作为参考。

实施例

引言部分

这段首先描述可以采集血液样品测定维生素E、维生素C、牛磺酸和类胡萝卜素的方法。还描述了血浆中组分的分析方法和食品中组分的测定方法。除了下面所述细节之外，关于分析过程的细节可以在McDowell L.R. (1989)Vitamin E：In Vitamins in Animal Nutrition Chapter 4，page 96，Academic Press，UK中找到。

血浆和全血牛磺酸

制备样品：

从头静脉或颈静脉将血样收集到肝素化瓶中。在滚筒上将样品混合之后，将这些样品保持在冰上，直到转移到实验室中。然后将全血在-20℃ 下冷冻，直到分析。另外为了测定血浆，通过将血样离心(在0℃、3500rpm 下持续10分钟)提取血浆。将血浆在-20℃下冷冻，直到分析。

通过以下分析猫血浆/血液中的牛磺酸：取出样品，通过与磺基水杨酸溶液反应离心出蛋白质。然后将样品离心并过滤出上清液。

参照以下测定猫中血浆牛磺酸：

Earle，K.E.和Smith，P.M.(1991)The effect of dietary taurine content on the plasma taurine concentration of the cat.British Journal of Nutrition 66，227-235.

血浆维生素C

制备样品：

从头静脉或颈静脉将血样收集到肝素化防光(箔包裹的)瓶中。在滚筒上将样品混合之后，将这些样品保持在冰上，直到转移到实验室中。通过将血样离心(在0℃、3500rpm下持续10分钟)提取血浆。将血浆在-20 ℃下冷冻，直到第二天分析。一直在照明受到抑制下制备样品。

1ml血浆用5ml提取剂(15g偏磷酸+0.475g EDTA+20ml冰醋酸于500ml 水中)提取-然后该步骤与用于产品的相同。

实现猫中血浆增加的维生素C的优选最小剂量为20mg/400kcal。实现狗中血浆增加所测定的维生素C的优选最小剂量为27mg/400kcal。

血浆维生素E

制备样品：

从头静脉或颈静脉将血样收集到肝素化瓶中。在滚筒上将样品混合之后，将这些样品保持在冰上，直到转移到实验室中。通过将血样离心(在 0℃、3500rpm下持续10分钟)提取血浆。将血浆在-20℃下冷冻，直到分析。

样品大小＝250μl。将样品提取到己烷中，之后加入醋酸生育酚作为内标准。将己烷蒸发，残余物溶于甲醇中并注射到HPLC上。使用逆相柱用甲醇作为洗脱剂进行分离，在285nm下进行紫外线测定。

达到猫中血浆增加的维生素E的优选最小剂量为34IU/400kcal。达到狗中血浆增加所测定的维生素E的优选最小剂量为50IU/400kcal。

血浆中类胡萝卜素的测定

从头静脉或颈静脉将血样收集到肝素化防光(箔包裹的)瓶中。在滚筒上将样品混合之后，将这些样品保持在冰上，直到转移到实验室中。通过将血样离心(在0℃、3500rpm下持续10分钟)提取血浆。将血浆在-80 ℃下冷冻，直到分析。一直在照明受到抑制下制备样品。

以下两种方法可用于测定血浆中的类胡萝卜素浓度。

方法1

第一种方法是测定感兴趣的主要类胡萝卜素，除用该方法不能分离的黄体素和玉米黄质之外。

用于检测类胡萝卜素的该方法是Craft，N.E.and Wise，S.A.， Journal of Chromatography，589，171-176，(1992)的一种变体。

从血浆中提取类胡萝卜素是使用Thurnham等人的Clinical Chemistry， 34，377-381，1988的一种变体进行的。

方法2

第二种方法是分离黄体素和玉米黄质，并分离这些类胡萝卜素的不同亚型。

用于检测这些类胡萝卜素的方法是Yeum，Kyung-Jin.等人的Am.J. Clin.Nutr，64，594-602，1996的一种变体。

从血浆中提取类胡萝卜素是使用Thurnham等人的Clinical Chemistry， 34，377-381，1988的一种变体进行的。

所有提取都是在照明得到抑制的情况下进行的，并且所有类胡萝卜素原液都贮藏在氩气下。

维生素C-食品产品

抗坏血酸是经酶氧化成脱氢抗坏血酸，它与邻亚苯二胺缩合成荧光喹噁啉衍生物。通过逆相HPLC将后者与干扰化合物分离，并用荧光计检测。

维生素A和E食品产品

将样品用乙醇氢氧化钾溶液水解且维生素萃取到石油醚中。蒸发除去石油醚，残余物溶于丙-2-醇中。通过逆相液相色谱法测定维生素A和E 在丙-2-醇提取液中的浓度。

自由牛磺酸-食品产品

自由牛磺酸是指在产品中营养性得到的牛磺酸。

通过如下分析自由牛磺酸：取出样品，加入稀盐酸。然后将其浸软并转移到定容烧瓶中。然后取出少量并加入磺基水杨酸，将蛋白质沉淀。然后将样品离心并将上清液过滤出。所得溶液与丹磺酰氯反应并使用荧光检测通过HPLC分析。

类胡萝卜素-食品产品

取出20-25g样品用于分析。在90℃、氮气以及用连苯三酚作为抗氧化剂下，样品用28％乙醇氢氧化钾皂化30分钟。冷却之后，将皂化的提取物用2×250ml混合醚(石油醚/乙醚1∶1)提取，将有机相用水冲洗直至中性。在真空下用BHT作为抗氧化剂在35℃将醚提取物蒸发，残余物再溶于HPLC移动相中。使用逆相HPLC在450nm下使用紫外线检测测定这些类胡萝卜素。

除了给出的这些试验工作之外，本发明通过给猫喂食该抗氧化合剂之后减少猫红细胞的渗透性脆性从而成为改善健康的指示剂。

测定红细胞经受渗透应力的能力。

该方法涉及将洗过的红细胞再悬浮于具有不同NaCl浓度的溶液中；它们经培养，然后分离。根据其渗透性脆性血红蛋白从这些细胞中释放。结果显示，喂食本发明抗氧化合剂的猫的红细胞显示了更大的渗透应力耐性，同时需要显著低浓度的NaCl诱导相同水平的溶血作用。红细胞耐受渗透应力情况的能力为生理状态提高的指示剂。

实施例1

维生素E

将一组8只狗供养营养上完全的饮食(见对照段的代表性饮食)持续6 周，然后接受两种补充水平的维生素E(下面的α-生育酚醋酸酯(表1))之一。

表1：补充之前试验饮食中的维生素E含量饮食补充之前的维生素E含量完全和平衡的 8.7IU/400kcal

在50IU/400kcal和100IU/400 kcal水平下补充仅1周之后，血浆水平都显著(p＜0.05)增加。

在补充1周后出现血浆饱和。在停止补充2周后血浆水平降低至基线水平。

由此研究可以推断，膳食补充维生素E使得狗的血浆状态显著增加 60-66％(图1)。

实施例2

猫的抗氧化剂补充

维生素C

将4组8或9只猫口服补充4种不同水平的维生素C，同时供养营养上完全的饮食(见对照饮食段)。

基线血浆维生素C水平证实，在补充之前4组之间没有显著差异。

正如在图2中可以看到的，7天内所有4组的血浆维生素C水平明显增加至补充之前的基线之上。

尽管更高维生素C补充导致更大的血浆值，但是在4组之间的这种增加没有明显差异。

补充结束之后，血浆维生素C水平回到基线。

这些数据证实，猫的抗氧化剂状态可以通过相对低水平的饮食维生素 C补充增加。

实施例3

维生素E

已评价了典型膳食维生素E水平对猫的维生素E状态的影响以及膳食补充的影响。

测定供给具有不同膳食维生素E水平的2种商业化营养完全的猫饮食 (参见对照饮食段)的2组12只猫的血浆维生素E浓度。表2中所示的血浆水平(2周间隔，一式两份测定)证实，供给4周较高维生素E水平的饮食的猫具有相对增加的维生素E状态。

表2：反映维生素E摄取的猫中的维生素E血浆状态维生素E含量血浆维生素E(±SD)ug/ml 60IU/400kcal 26.62±7.2 24IU/400kcal 15.09±4.0

为了测定补充的效果，将口服维生素E补充物(α-生育酚醋酸酯)给予一组12只猫，同时供给营养完全的饮食。

补充的效果可以见图3。补充之后血浆维生素E水平显著增加，在补充约4-6周之后达到饱和。

因此，膳食维生素E补充可以强化猫的抗氧化剂状态。

实施例4

猫中总血浆抗氧化剂；正常范围和年龄的影响。

家庭猫中的总抗氧化剂状态以前从未报道过。该研究的目的是验证一种测定猫中总抗氧化剂状态的方法、测定健康成年猫中的正常总抗氧化剂的范围并研究年龄对总血浆抗氧化剂状态的影响。

用Randox Laboratories Limited生产的比色测定试剂盒(NX2332)验证猫中总抗氧化剂状态的测定。通过猫血浆样品的重复分析和商业化质量控制(QC)材料(PAR 721013和PAR 721014；Bio-stat Diagnostics) 的重复分析确定测定精度，内和中间变异系数证实血浆样品的分光光度测定的可接受的变异CV＜10％且QC CV＜5％。猫血浆的稀释在测定中产生线性反应。

评价年龄对血浆抗氧化剂水平的影响。供给营养完全猫食品(参见饮食对照段)的134只猫参与该研究。在来自69只雄性和65只雌性年龄在6 个月至14岁之间的家庭短毛猫的单个血浆样品中评价所有抗氧化剂状态。所有方式都引入±标准偏差(SD)。

结果显示，在约6岁龄时存在抗氧化剂状态的过渡期。Newman-Keuls 多样范围试验显示，6岁龄猫的总血浆抗氧化剂状态显著(p＜0.01)高于6.5 岁龄的(参见表3)。不清楚该年龄的抗氧化剂状态衰退是否标志着对疾病的更大易感性，或者该年龄的抗氧化剂状态是否影响猫的寿命。

表3：根据年龄分类的猫的平均总血浆抗氧化剂浓度年龄分类(岁) 总血浆抗氧化剂状态(mmol/1)SD 动物数量＜6 0.920±0.77a 47 6 0.872±0.182ab 9 ＞6 0.799±0.092b 78

上标表示同种组。

实施例5

狗中总血浆抗氧化剂和超氧化物歧化酶

有关家庭狗中抗氧化剂状态的了解很少。本研究的目的是验证一种狗中总血浆抗氧化剂(TPAO)和红细胞SOD(超氧化物歧化酶)活性的正常范围的测定方法。

将Randox laboratories Limited生产的比色测定试剂盒用于确定狗中TPAO状态(试剂盒号：NX2332)和SOD状态(试剂盒号：SD 125)。就TPAO 而言，通过一式两份分析狗血浆样品和商业化质量控制(QC)材料(PAR 721013和PAR 721014：biostat Diagnostics)确定测定精度。内和中间分析变异系数(CV)证实分光光度测定的可接受的变异，血浆样品CV＜10％和QC＜5％。通过一式两份分析狗红细胞样品确定SOD状态测定精度。内和中间分析变异系数(CV)是指红细胞样品的分光光度测定的可接受的变异 CV＜10％。

在9个月至16岁之间年龄段的30条雄性和20条雌性狗中评价TPAO 和红细胞SOD状态。代表了10个品种。所有狗临床上都正常，并已长期供给各种营养完全的饮食。年龄与TPAO或SOD活性之间没有明显关系。狗不等价代表横跨年龄组(数据未显示)，进一步的工作以评价观察是否得到更大样品和更好年龄扩散的支持。在性别之间平均TPAO状态(雄性： 0.719±0.135，雌性：0.786±0.101)或SOD活性(雄性：1275.41±264.46，雌性：1267.61±166.34U/g Hb)没有看到显著差异。然而，Bartletts测定显示了雄性(6994.0)和雌性(27670.3)狗中SOD活性方差之间的显著差异(p＜0.05)。

对具有5或更多代表性的这些品种分析显示，在与性别无关的品种之间对SOD活性和TPAO状态存在显著差异(p＜0.01)。Newman-Keuls多样范围测定显示，Beagles比Labradors和Yorkshire Terriers具有明显低的平均SOD活性(p＜0.05)和平均TPAO状态(p＜0.01)，表4。

表4：三个品种的狗的超氧化物歧化酶和总血浆抗氧化剂活性品种平均SOD活性±SD 平均TPAO活性±SD n Beagle 1084.70±136.24a 0.569±0.094a 10 Labrador 1323.65±185.77b 0.830±0.113b 15 Yorkshire Terner 1293.76±215.54b 0.798±0.036b 5

上标表示栏内的同种组(Newman-Keuls多样范围测定)

n＝动物数量

这些数据显示，它不足以假定狗中正常SOD和TPAO范围的单个值。在这种需要两个值的情况下，一个为Beagles的，一个为两个品种之一的。 Beagles中TPAO状态和红细胞SOD活性的平均范围的95％可靠间隔分别为0.569±0.067mmol/1和1084.9±97.27U/g Hb；并且两个品种中另一个为0.822±0.047 mmol/1和1316.2±88.03U/g Hb。

实施例6

使用全自动比色测定评价猫和狗中的总抗氧化剂状态

该研究的目的是验证用Randox Laboratories Ltd生产的比色测定试剂盒测定猫和狗中总抗氧化剂状态。其次，该验证测定用于评价猫和狗中总抗氧化剂状态随年龄的变化并以其它生物化学和血液参数比较这些变化。该测定将2，2’-连氮基-二-(3-乙基苄噻唑啉氨基磺酸盐)(ABTS) 与过氧化物和H2O2反应产生残基阳离子ABTS+，它可以在600nm下测定。样品中存在的抗氧化剂使得该颜色的产生抑制到与其浓度成比例的程度。使用Randox Laboratories提供的方案在Cobas Mira分析器(Roche Diagnostics)上进行该测定。测定精度通过对猫和狗血浆样品和商业化质量控制(QC)材料的一式两份分析来确定。内分析和中间分析CV都低于 QC材料的5％，并且对猫和狗血浆样品都低于10％。猫和狗血浆的稀释在测定中产生线性反应。对不同年龄的家庭短毛猫和几个血统品种的狗进行包括总抗氧化剂状态的常规血液学和生物化学图谱。猫中抗氧化剂状态增加高至2月龄，然后显示接下来的衰退。性别差异不明显。小于1 岁的雌性狗显示抗氧化剂状态轻微降低，否则随年龄没有明显变化。多重回归分析证实，猫中抗氧化剂状态、白蛋白、天冬氨酸盐氨基转移酶和钙之间的关系，狗中抗氧化剂状态、磷酸盐和丙氨酸氨基转移酶之间的关系。确认结果是可以接受的，并且该测定适合确定猫和狗中总抗氧化剂状态。

实施例7

维生素C补充物对健康成年猫中血浆状态的影响

维生素C为体内主要水溶性抗氧化剂，它可以延迟或抑制氧化，特别是在细胞外液中很重要。然而，以前从未研究过猫(Felis domesticus) 对不同维生素C膳食水平的反应。本研究的目的是确定在健康成年猫中补充维生素C对血浆状态的影响。

通过逆相高效液相色谱法测定33只猫的血浆维生素C浓度。接着通过分层随机抽样将这些猫分成4组，确信这4组的基线血浆维生素C水平之间没有显著差异(ANOVA p＞0.05)。将日维生素C补充物(结晶L-抗坏血酸，ICN药剂，UK，为明胶胶囊，Analytical Supplies Limited，UK) 连续21天口服给这些猫。给予这4组猫3.5、7.0、10.5或者21.0mg 维生素C/天。在补充的第7、14和21天以及补充后第21天测定血浆维生素C水平。所有猫保持营养完全的罐装饮食，其中维生素C含量为11.6 mg/1.6MJ。

在日补充之后的第7天在所给的所有4个膳食水平下这些猫的血浆维生素C水平都增加(成对t-test p＜0.05)，并且补充期间保持这些水平，表5。尽管当与较低膳食水平的那些比较时，维生素C的膳食补充水平越高，血浆值达到越大，但在膳食组之间的血浆增加没有显著差异(使用常规线性模型重复测定多个因素ANOVA p＜0.05)。在补充之后第21天，所有猫的血浆水平回到基线水平。

表5：血浆维生素C浓度(ug/ml±SD) 组 n 补充时间(天) 补充21天之后 0 7 14 21 1 8 3.93a±0.98 4.73b±0.71 4.73b±0.39 5.02b±0.64 3.66a±0.74 2 8 4.16a±1.18 5.28b±0.99 5.55b±0.67 5.20b±0.82 4.17a±0.73 3 8 4.34a±1.24 5.20a±1.16 5.46b±1.02 5.42b±1.28 4.56a±1.14 4 9 4.41a±0.96 5.91b±1.04 5.90b±0.54 5.85b±0.80 4.17a±0.65

各行中异种上标显示了随时间的显著差异(ANOVA p＜0.05)

这些数据证实，以每天基础给予低水平的维生素C膳食补充，猫的血浆状态可以明显提高。为了保持该提高的血浆状态，需要连续补充。

实施例8

猫和狗中血浆血浆铜蓝蛋白浓度的确定和正常范围。

该铜合酶，血浆铜蓝蛋白对身体具有许多功能作用。作为贮藏铜的蛋白质，血浆铜蓝蛋白帮助游离铜离子抗催化能力。游离铜可以通过单电子(基团)转移加速自动氧化反应，还与过氧化氢反应形成高反应性的氢氧根，它可以引起细胞分裂。当外伤时，血浆铜蓝蛋白还促进铁从其预氧化剂亚铁形式转化成三价铁离子。作为急性相蛋白质，血浆铜蓝蛋白可以指示发炎或感染，并因此用于与血清铁蛋白结合测定铁贮藏。

基于对苯二胺为底物的Sunderman F.W.和Nomoto，S.(1990)Clin. Chem 16，903方法验证了一种测定猫和狗中血浆铜蓝蛋白氧化酶活性的比色法。在单一运转下将两只狗和两只猫的血清样品分析10次。测定狗样品的内分析变异系数为1.94％和2.95％，猫样品的内分析变异系数为1.81％和3.94％。对10个单独天的相同样品，测定狗样品的中间分析的变异系数为8.21％和7.01％，猫样品的中间分析的变异系数为6.88％和9.35％。因此获得可接受水平的内和中间分析的变异性。之后，评价血清和血浆样品中血浆铜蓝蛋白浓度的差异。在每一种中测定血浆和血清样品之间差异不显著。因此为了降低所需样品的总体积，收集血浆样品。

为了确定正常范围，从102只健康狗(混合种、年龄和性别)和54只健康家庭短毛猫(混合年龄和性别)获得血浆样品。测定狗和猫的平均血浆铜蓝蛋白浓度分别为9.28IU/L(SD 3.03IU/L)和10.90IU/L(SD 3.34 IU/L)。使用这些值，确定狗的正常范围(平均±2SD)为3.22IU/L-15.35 IU/L，猫的为4.22IU/L-17.58IU/L。确定的狗的正常范围与前面报道的(Solter P.F等人(1991)Am J Vet Res 52，1738，1991)一致。以前从未确定过猫的正常范围，然而它的与狗的相似，这暗示在这两个种之间血浆铜蓝蛋白循环水平有很少的差异。在本研究期间确定的正常范围可用于评价猫和狗的健康状况。

实施例9

犬铁蛋白：分析验证和血清的正常范围

铁蛋白在身体的抗氧化剂防御系统中起着重要作用。作为铁的高亲和力贮藏蛋白，铁蛋白使铁保持安全结合形式，它防止了反应性亚铁离子参与Fenton反应，该反应可以导致氧化损伤。在正常健康铁蛋白中，种特异性蛋白质，如果在血液中发现其浓度，反映身体铁贮藏的浓度并与其它参数结合可用于评价体内铁状况。为了确定狗中循环铁蛋白水平，开发了一种酶链免疫测定(ELISA)，并采用使用单克隆抗体的Weeks，B.R. 等人(1988)Am J Vet Res 49，1193)(1988)方法。该测定验证之后，确定狗的正常范围。

在0-40ng/ml的范围内，铁蛋白标准为线性(最小平方回归分析， r＝0.997)并加入到犬血清的纯化铁蛋白的回收率为97.7％。由测定两个血清样品的铁蛋白浓度12次获得的内分析变异系数为8.2％和6.6％。在单独天两个血清样品测定10次的中间分析变异系数为16.6％和16.2％。

为了确定正常范围，血清样品从96个测定铁蛋白用的混合性别和5个不同种的健康狗获得。每种样品分析三次或四次，将这些值的平均值用作样品的铁蛋白浓度。血清铁蛋白浓度的范围为67.20-621.07，平均值为371.62ng/ml(SD 102.85ng/ml)。这些数据正常分布。这些结果证实，可以良好重复性和再现性地测定狗的血清铁蛋白。获得的值将用作未来研究的正常范围，并且可以提供一种测定狗中铁贮藏水平的有用方法。

实施例10

补充膳食生育酚将使正常范围之外的犬血浆值增加

维生素E是8种自然存在的分子—4种生育酚和4种生育三烯酚的共同名称。不同形式的生物活性大致与其抗氧化活性有关，相对过氧化清除反应性的次序为α＞β＞γ＞δ-生育酚。通常提供过量需求的营养物不会带来任何测量益处。成年狗中维生素E的最小需求已确定为2.5IUα-生育酚/400kcal饮食(Nutrient Requirements of Dogs(1985)National Research Council(U.S.)National Academy Press Washington DC ISBN；0-309-03496-5)。制备的宠物食品典型地含有高达10倍的该量，但通过宠物食品中的维生素E的正常范围，血浆浓度趋于恒定。在评价补充的维生素E对血浆反应的影响时，将6只成年给予营养完全(见饮食对照段)罐装狗食品(维生素E含量为8.2mg/400kcal(8.2IU/400kcal) 的狗，提供6周的补充物，其相当于100IU维生素E/天。对照组6只狗保持在相同条件下，但是未接受补充膳食。在补充期间或补充之后的4 周内监控血浆α-生育酚。

血浆α-生育酚浓度示于表6中。处理组的平均基线α-生育酚水平与对照组的没有明显差异(p＝0.43)。补充2周后，与对照(p＝0.002)和其基线 (p＜0.001)相比，处理组的平均值明显增加。在第56和70天(补充后第14 和28天)进行测定，显示其水平明显高于基线。这些结果清楚地说明，典型地在制备的宠物食品中发现的水平之上的膳食维生素E可以使狗中血浆状态上升，补充之后这可以维持几周。为了使血浆饱和，很显然需要喂食比目前在制备的宠物食品中发现的那些更高的浓度。只要维生素E 的抗氧化能力有效，可以审慎地增加狗中维生素E状态，以便最大化地防止自由基损伤和相关退化病的机会。

表6：健康狗中对α生育酚补充的血浆反应基线第14天第28天第42天第56天第70天测定 15.9±5.91◆ 3.67±6.65* 32.6±8.39* 35.4±7.07* 363±7.50* 28.2±6.87* 对照 18.4±5.03*◆ 22.2±7.29 19.9±4.00* 23.2±4.13* 30.5±7.93 23.3±3.71*

*代表相同组中的均匀性(p＞0.05)

◆代表2组之间的均匀性(p＞0.05)

实施例11

健康狗中典型血浆维生素E范围

维生素E是8种具有相同生物活性的不同生育酚和生育三烯酚的共同名称。这8种中，α-生育酚为生物和化学上活性最大形式的维生素E，1mg α-生育酚相当于1IU维生素E。维生素E为体内的有效的抗氧化剂，它主要留在生物膜中，在其中它防止膜磷脂免受过氧化破坏。维生素E还抑制维生素A氧化，因此还防止维生素A缺乏。已确定成年狗中对维生素E的最小需求为2.5IU α-生育酚/400kcal饮食(Nutrient Requirements of Dogs(1985)National Research Council(U.S.) National Academy Press Washington DC ISBN；0-309-03496-5)。然而，关于健康成年狗和幼犬中的正常维生素E血浆值只有少量信息。为了确定健康成年和幼犬中典型基线血浆α-生育酚水平，在喂食一定罐装和干燥营养完全制备的宠物食品的狗中进行了一系列研究(参见饮食对照段)，表7。根据体重喂食饮食(110 kcal/kg0.75)。单个血浆α-生育酚水平的范围为9-39.2mg/l，平均值为21.1mg/l。供养不同饮食的狗的组的平均基线α-生育酚水平之间没有显著差异(p＝0.24)。这些数据说明，在幼犬和成年狗中典型α-生育酚水平相似，并且在制备的宠物食品中发现的常规维生素E水平内，血浆生育酚水平呈现相似范围。

表7：用相应平均血浆α-生育酚水平(mg/l±SD)显示饮食α-生育酚水平(IU/400kcal) 食品形式 α-生育酚含量 (IU/400kcal) 血浆生育酚 (mg/l±SD) n 罐装 9.77 21.15±6.4 20 干燥 6.31 22.72±6.62 6 干燥 13.76 25.33±5.12 10 干燥 18 21.56±4.88 23

实施例12

健康成年狗锻练使血浆TBARS-氧化应力指示剂增加

通过预柱衍生化的HPLC测定的血浆TBARS(硫代巴比妥酸反应性物质) 为体内脂质过氧化的公知标记物。本研究的目的是调查狗(Canis familiaris)锻练一次对氧化应力指数的影响。

在该试验之前3个月和整个该试验过程中将一组14只混合种和年龄的狗给予营养完全的商业化干饮食。在急性20分钟一次围场锻练之后立即通过测定形成的丙醛(MDA)作为TBARS定量脂质过氧化程度。该分析是按照如下所述方法测定的：Bird，R.P.和Draper，H.H.(1984)，Methods in Enzymology.105：299-305(1984)。这些结果证实：锻练之后血浆 TBARS(Paired TTest p＜0.05)显著增加(22％)(锻练前0.74μM±0.2，锻练后0.92μM±0.2)。为了检查锻练后存在的增加是浓缩血液体积的直接结果，测定PCV(包裹的细胞体积)和血浆白蛋白。结果证实锻练前和锻练后没有明显差异(p＞0.05)，因此从该研究的观察暗示，体内增加的脂质过氧化以锻练诱导的氧化应力的直接结果存在。现有文献提出，氧化损伤的特定位置为细胞膜，由此在高氧化应力条件下过氧化残基(RO2)增多。这种观察推断在健康成年狗中膳食脂质相抗氧化介入的潜在作用。

下面描述动物抗氧化状态的其它例子和本发明抗氧化合剂对动物的影响。

实施例13

家庭猫中膳食类胡萝卜素吸收

现发现，将抗氧化剂如β-胡萝卜素和番茄红素加入商业化猫食中将明显增加猫对类胡萝卜素的吸收，尽管它们的代谢适应食肉。在该研究中，使用具有相同基本配方的相同批次的原料生产三种罐装猫食。对照饮食，饮食A，具有3.39MJ/kg的可代谢能量(ME)含量，且β-胡萝卜素和番茄红素含量＞0.1mg/1.67MJME。饮食B补充有红色棕榈油(3.70MJME/kg)， β-胡萝卜素含量为0.36mg/1.67MJME并且番茄红素含量＞0.1MG/1.67 MJME；饮食C补充有番茄浮石(3.54MJME/kg)，且β-胡萝卜素含量＞0.1 MG/1.67MJME，番茄红素含量为0.9MG/1.67MJME。

该研究选择了2组各5只健康猫。组1中的猫的平均年龄为8.72岁 (SD2.1岁)，包括3个雄性和2个雌性。组2中的猫的平均年龄为7.4岁 (SD1.7岁)，包括2个雄性和3个雌性。该研究的所有猫以前都给予各种市购营养完全且制备好的猫食，然后给予几天的饮食A，使其喜欢该饮食。在本研究的第8天，测定基线血浆类胡萝卜素水平。接着，将组1 猫喂食饮食B，组2猫喂食饮食C，持续5天。在本研究的第13天，以相同方式重复抽取血浆作为基线样品。通过高效液相色谱法进行分析。

给予饮食B的组1猫中β-胡萝卜素浓度明显增加(平均17.62ng/mL，SD 2.50ng/mL)至基线值(平均6.35ng/mL，SD 3.23ng/mL)之上。在该组中，血浆番茄红素浓度保持在检测的限度之下。在给予饮食C的组2猫中，基线水平(平均5.30ng/mL，SD5.78ng/mL)和喂食后水平(平均6.61ng/mL， SD2.83ng/mL)的血浆β-胡萝卜素浓度没有明显改变。然而，组2中猫显示，血浆番茄红素浓度从基线水平的0ng/mL至喂食后水平的平均 14.6ng/mL，SD7.25ng/mL明显增加。

因此，本研究证实了，抗氧化剂的天然来源如β-胡萝卜素和番茄红素加入到市购猫食之后将使得猫对类胡萝卜素的吸收明显增加，尽管其代谢适应食肉性。循环抗氧化剂时的这种增加将赋予猫抗氧化剂状态的有益效果。类胡萝卜素以低膳食浓度在猫中的这种增加的吸收至今还从未看到过。

实施例14

母乳可能不足以使发育中的小猫的抗氧化剂状态最大化。

就免疫功能而言，抗氧化剂的效果同样可以适用于因年龄具有受损免疫功能的动物如成长动物以及接受免疫攻击的那些动物。以下研究的结果显示，母乳可能不足以使发育中的小猫的抗氧化剂状态最大化，反而可能使小猫对氧化应力的易感性增加。因此，可以发现，以膳食给小猫补充抗氧化合剂同样显示出与接受抗氧化合剂补充物的幼犬中发现的抗体反应时间的提高。

哺乳动物抵抗氧化损害的能力既取决于其内部抗氧化剂防御系统又取决于饮食提供的整个抗氧化剂状态。测定动物抗氧化剂状态的一种方式是评价其总血浆抗氧化能力(TPAO)。已将Randox Laboratories Ltd.生产的比色测定试剂盒用于猫中测定TPAO的正常范围。在与其血液浓度成比例的试验中血样中存在的抗氧化剂将使色彩产生受到抑制。

进行本研究，以确定健康小猫中TPAO的正常范围并确定年龄与TPAO 之间是否存在任意关系。适用上述方法分析样品，适用ANOVA比较这些结果。结果示于下表7中。

表7 小猫年龄 TPAO 14天 0.694±0.069 35天 0.853±0.083 60天 1.030±0.113

从这些结果可以看出，乳猫的TPAO状态为正常成年范围的底端，仅达到35-60天的成年水平。在出生后的14天，小猫完全受母乳的支配提供其营养需求。在35天龄时，小猫非常小地受母乳依赖，并从销售的食品中获得大部分营养摄取，而在60天时，它们完全断奶。这些结果暗示，母乳不足以使发育中的小猫的抗氧化剂状态最大化，反而有利于使小猫对氧化应力的易感性增加。

实施例15

抗氧化剂强化的饮食使猫的抗氧化能力增加。

根据年龄和性别，将一组46只健康家庭短毛猫随机地分成2组各23 只猫。组A给予对照基础饮食(按照对照区的完全湿的饮食)，组B给予补充有抗氧化混合剂的饮食，时间为30周。

混合剂为：

维生素E 50ICT/400kcal饮食

维生素C 20mg/400kcal饮食

β-胡萝卜素 0.5-1mg/400kcal饮食

黄体素 0.5mg/400kcal饮食

牛磺酸 200mg/400kcal饮食

番茄红素 1mg/400mgkcal饮食

从所有猫中获得禁食样品并使用铁还原性抗氧化剂粉末(FRAP)和铁还原性抗氧化剂粉末和抗坏血酸浓度(FRASC)试验评价抗氧化能力。

就FRAP和FRASCT而言，与组A相比，组B中的抗氧化能力显著增加 (p＜0.05) 组平均FRAP±SD 平均FRASC±SD A 260.45±55.59 28.05±7.93 B 297.63±57.18 36.33±10.69

因此，喂食抗氧化剂强化饮食的猫中的抗氧化能力增加，这使得减轻与氧化损伤有关的有害影响的能力增加。

实施例16

补充抗氧化剂的饮食对猫免疫状态的影响

试验设计：

测定基线之后对48只正常健康的猫喂食对照饮食(每个对照段的完全饮食)持续6周。然后将这些猫分成对照或处理年龄相配的组，并喂食实施例15中所述的补充饮食。在第8周时对动物抽样，以便测定血清免疫球蛋白浓度。在第12周时测定免疫参数并对这些猫免疫(使用抗猫泛白细胞减少症、猫杯状病毒和猫疱疹病毒的标准组合疫苗)。在第18周时进行免疫后的最终测定。

所用方法：

通过促细胞分裂剂诱导的淋巴细胞转化测定(MILT)评价外周血液单核细胞(PBMC)增殖反应

在Histopaque 1077(Sigma)上通过密度梯度离心将周围血液单核细胞从肝素化血液中分离。这些细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗2次，用补充有10％热失活的胎牛血清、1％青霉素/链霉素和2％丙酮酸钠的RPMI- 1640(Dutch modification)冲洗1次。通过台盼蓝排除试验(Sigma)评价细胞生存能力。

将细胞一式三份以1×105/井在96孔平底微量滴定平皿中在37℃下用植物凝集素(PHA)(5g/ml)(Murex)、刀豆球蛋白A(Con A)(7.5μg/ml) 和美洲商陆促细胞分裂剂(PWM)(1μg/ml)(Sigma)培养96小时。在培养的最后18小时内以每分钟加入的[3H]-胸腺嘧啶核苷的数量(CPM)(0.5 μCi/井)测定增殖。

通过流式细胞计分析淋巴细胞子集

CD4和CD8阳性细胞为猫免疫学中最公知特征的淋巴细胞子集，适宜全部的这些细胞说明了健康免疫系统。既使用提纯的淋巴细胞又使用全血并选择各种单克隆抗体(Mabs)进行该测定。

结果

通过促细胞分裂剂诱导的淋巴细胞转化测定(MILT)评价PBMC增殖反应

表8显示了免疫攻击之前和之后PBMC对促细胞分裂剂PHA、Con A和 PWM的反应。促细胞分裂剂诱导的淋巴细胞之后测定(MILT)数据未显示出对照或者处理组的增殖反应的变化。当进行刺激指数分析时，从免疫前到免疫后在处理组中PHA刺激指数(SI)(p＜0.05)和Con A指数(p＜0.001) 都明显降低。对照组的SI没有明显差异。在两个组中从基线到免疫前 Pokeweed SI都明显增加(p＜0.05)，免疫后处理组中明显降低(p＜0.01)。

表8

在免疫攻击之前和之后PBMC对促细胞分裂剂PHA、Con A和PWM的反应 [3H]胸腺嘧啶核苷加入量(数/分钟)CPM×10-3平均±SEM 刺激指数(S.I.)平均±SET

基线免疫前免疫后

标准a lara plusb 标准 lara plus 标准 lara plus

(n＝22) (n＝23) (n＝22) (n＝23) (n＝22) (n＝23) 未刺激 20±4 21.6±4 27.2±3.6 18.2±3 30.9±3.9 25±2.6 PHA 38.8±4 41.5±6 33.7±3.9 28.5±3.2 38.8±4 33.3±3 S.I. 2.01±0.2 2.69±0.5 1.38±0.1 2.2±0.25 1.8±0.58 1.49±0.14* Con A 29±3 32.4±4.5 31.4±3.5 38±5.9 37.9±4 33±3.6 S.I. 1.55±0.1 1.85±0.2 1.38±0.1 2.3±0.1 1.81±0.5 1.46±0.15*** PWM 21.5±2.5 22±4 37±4.2 29.7±3 37.8±4 29.7±3.3 S.I. 1.1±0.1 1.25±0.15 1.5±0.2* 2.52±0.4* 2.03±0.7 1.26±0.1**

a对照组，标准饮食 *P＜0.05；**P＜0.01；

b处理组，测定饮食 ***P＜0.001

通过流式细胞计分析淋巴细胞子集

表9显示了免疫前和免疫后T-细胞相对子集数和CD4+∶CD8+比。当分析CD4和CD8 T-细胞子集时，在两个组中CD4阳性细胞(p＜0.05)的百分数都明显增加，并且在免疫之后对照组(p＜0.05)和测定组(p＜0.001)的CD8 阳性细胞都明显增加。

当测定淋巴细胞的CD4+∶CD8+比时，发现免疫攻击之后对照组(p＜0.001) 中明显降低，而处理组中保持恒定。当测定年龄关系时，在免疫之前对照组中随年龄增加CD4+∶CD8+比趋于降低(r＝-0.483，p＜0.05)。表9 免疫前和免疫后T-细胞相对子集数和CD4+∶CD8+比，MEAN±SEM

免疫前免疫后

标准a lara plusb 标准 lara plus

(n＝21) (n＝23) (n＝21) (n＝23) CD4阳性百分数 22.6±1.1 20.9±0.7 25.1±1.6* 24.5±1.3* CD8阳性百分数 17.2±0.1 15.4±1.3 22.3±1.2* 19.6±1.6** CD4∶CD8比 1.42±0.1 1.57±0.1 1.17±0.1** 1.43±0.1

a对照组，标准饮食 *P＜0.05；**P＜0.001

b处理组，测定饮食

从给予补充饮食的猫中观察到PWM刺激细胞的SI的差异(表8)暗示， CD2-T-细胞的激活标记物有益地上调。

表9的结果清楚地显示了补充饮食对接种后猫的CD4∶CD8比的有益效果。与对照组相比，在补充过的猫中保持CD4∶CD8比。这种维持主要是因为CD4增加。

这些事实显示了补充物对猫免疫反应的有益效果。

实施例17

抗氧化混合剂对幼犬的特异性抗体反应的影响

●将几个Labrador幼犬和Greyhound幼犬分成两个年龄和性别搭配的组。

●一组每个品种补充有混合剂(详细如下)的标准饮食(完全，与每个对照段相同)，另外两组(每个品种一个)给予未补充的饮食。抗氧化混合剂-

α-生育酚 50mg/400kcal

抗坏血酸盐 20mg/400kcal干(如果是湿的话为40mg)

β-胡萝卜素 0.5mg/400kcal

黄体素 0.5mg/400kcal

牛磺酸 200mg/400kcal干(如果是湿的话为500mg)

●在接种之前补充物使用高达最大4周。

●所用幼犬按照常规接种步骤进行接种(疫苗包括细小病毒和瘟热)。

●对所用幼犬测定疫苗抗原的抗体水平。

●这些结果一些示于图4、5和6中。

●这些结果清楚地说明，接受抗氧化混合剂补充物的幼犬将对例如通过疫苗引入的或者可能通过与感染性试剂接触引入的特异性抗原更快地作出反应。

●这些结果显示，抗氧化合剂对幼小动物的免疫反应具有高度有益效果。

实施例18

在成年和年长狗中抗氧化混合剂对保持疫苗反应的有益效果

●2组狗的年龄、性别和品种搭配。

●2组还都按照它们以前接种的时间搭配(在开始本研究之前)。

●1组喂食补充有抗氧化混合剂(详细如下)的饮食，另一组给予未补充的对照。

表10 饮食中抗氧化剂含量补充的测定饮食对照饮食维生素E 52.41IU/400kcal 4.81IU/400kcal 维生素C 65.9mg/400kcal 2.48mg/400kcal 牛磺酸 0.16％ 0.054％类胡萝卜素 -顺式β-胡萝卜素 -反式β-胡萝卜素 -反式α-胡萝卜素 -顺式α-胡萝卜素 -黄体素 -番茄红素 -Xeaxanthian 11.07μg/400kcal 33.21μg/400kcal ＜11.07μg/400kcal ＜11.07μg/400kcal 0.996mg/400kcal ＜11.07mg/400kcal 1.22mg/400kcal ＜10.96μg/400kcal 21.91μg/400kcal 10.96μg/400kcal ＜10.96μg/400kcal 0.877mg/400kcal ＜10.96μg/400kcal 1.32mg/400kcal

●喂食6个月补充饮食之后，测定这些狗的循环抗腺病毒抗体滴度。结果示于图7。

●这些结果显示，给予含有抗氧化混合剂的饮食的动物比未补充的狗能够长时间地较好保持疫苗诱导的抗体。

实施例19

给予含有抗氧化混合剂的干燥狗饮食8周后狗中抗氧化剂状态和氧化损伤

简述：

●该报告含有来自喂食含有抗氧化混合剂的干燥狗饮食8周的狗的结果 (抗氧化剂状态和氧化损伤)。一些结果受饮食和年龄影响。

●给予抗氧化剂的组中血浆FRAP和维生素E水平明显高于喂食对照的组中的。

●给予抗氧化剂饮食的年轻成年和年长狗中血浆维生素E水平都明显高于其相应对照组中的。

材料和方法

动物

1)动物类型

该研究包括了40只年轻成年(0.8-3.3岁)和年长(6.5-12.5岁)、纯种(Labradors、Beagles、West Highland white terrier、Newfoundland 和Golden Retriver)、以及性别混合的狗(无伤、阉割/切除卵巢)。

2)居住处

将狗成对分组并且都可以从其栅栏到外面环境。在白天和晚上所有狗都可以进入户内。来自相同处理组的狗住在一起，防止因食粪癖(粪便消耗性疾病)交叉污染。温度控制在22℃，具有自然光循环。允许狗保持其日常定期锻练程序。

3)喂养方案

在开始本研究之前所有狗都给予1周完全且平衡的干燥狗饮食。适应 1周之后，2/3的狗作为对照组喂养基本饮食，而剩余1/3转为测定饮食。喂食每只狗的食品量根据保持体重进行调节。在所有时间所有狗都可以使用新鲜水。

测定物质

测定饮食含有以下组分，而它们不加入对照饮食中。组分％加入饮食的番茄酱 5 维生素C35％ 0.18 牛磺酸 0.14 维生素E50％ 0.12 金盏花粉 0.04

试验设计

本研究为纵向试验设计。所有狗以品种、性别、年龄、体重和健康状况为基础随机分配。组数/组年龄(岁) 饮食测定时间对照 (A，B，E，F) 26 5.5±4.3 对照饮食(w/o抗氧化混合剂) 8周测定(C，G) 14 5.9±4.4 抗氧化混合剂饮食 8周

狗与上表中相同，但是它们按照年龄分开。组数/ 组年龄w/组 (岁±SD) 饮食测定时间年轻成年对照 (A，B) 12 1.2±0.8 对照饮食 8周年轻成年测定(C) 6 1.0±0.1 抗氧化混合剂饮食 8周年长对照(E，F) 14 9.3±2.0 对照饮食 8周年长测定(G) 8 9.5±1.5 抗氧化混合剂饮食 8周

血液和唾液生物标记物：从每只狗收集血液，测定处理8周后的以下参数。抗氧化剂/损伤说明血浆维生素E 脂溶性抗氧化剂血浆FRAP/FRASC 测量血浆和抗坏血酸水平中的 “抗氧化剂粉末”

统计学

通过p＜0.05下处理之间的统计学显著性的unequal n’s Tukey’s post hoc test分析所有狗的所有参数。数据以组的平均数±SD表示。

图8：测定血浆中三价铁的还原能力(FRAP)，它是连续8周测定给予含有抗氧化混合剂的干燥狗饮食的狗中的“抗氧化能力”。(对照，n＝26；测定，n＝14)。*代表与对照组差异显著，p＜0.05。

●处理8周之后在测定组中测定的血浆“抗氧化能力”明显高于对照组中的。

图9：连续8周测定给予含有抗氧化混合剂的干燥狗饮食的狗中的血浆维生素E水平。(对照，n＝26；测定，n＝14)。*代表与对照组差异显著， p＜0.05。

●处理8周之后在测定组中的血浆维生素E水平明显高于对照组中的。

对照饮食段

营养完全的饮食

食用的完全饮食，特别是营养完全的宠物食品(或饮食)为满足单个动物生活方式和生命的所有营养需求的一种饮食。

该饮食或食品可以按照本领域已知的任意方法制备，例如Waltham Book of Dog and Cat Nutrition，Ed.ATB Edney，Chapter by A.Rainsbird， entitled"A Balanced Diet"in pages 57 to 74，Pergoren Press Oxford。

以下显示了一种按照这些实施例的完全平衡的饮食组成。组分包含大米 24.9％完整玉米 18.8％完整颗粒小麦 12.2％副产品鸡肉 18.7％玉米面筋粉 9.5％啤酒酵母 1.7％干鸡蛋 0.8％非碘化盐 0.7％维生素预混物 3.4％向日葵油 0.5％牛油 4.9％家禽肠 4.4％

分析图谱-水分8.2％，蛋白质26.4％，脂肪10.4％，灰分7.1％，纤维2.2％ (其余物由无氮提取物(主要为碳水化合物)构成)。