一种猫遗传病SNP位点检测试剂盒的制作方法

一种猫遗传病snp位点检测试剂盒
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体为一种猫遗传病snp位点检测试剂盒。

背景技术：

2.该体系用于体外定性检测猫口腔拭子基因组dna中与猫五项高发遗传病相关的10个snp位点，辅助猫的临床诊断和精准繁育：判断猫是否患有以上猫五项高发遗传病，同时检测猫是否携带以上猫五项高发遗传病的致病基因，可指导精准繁育，逐步降低致病基因在猫中的存在概率；
3.为了让宠物猫拥有更招人喜爱的模样，很多品种猫都是近亲交配的产物，进而导致这些猫有极高的可能性患上某些遗传病，如多囊性肾病、先天性视力障碍、先天性心脏病等。当孕育者携带突变基因时，后代的患病率将会大大增加，最终影响猫的健康与寿命。为了提高猫的生存率和生活质量，避免后代因近亲繁育而患有先天性遗传病，对亲代孕育前进行基因诊断是非常有必要的。
4.snp全称single nucleotide polymorphisms，是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入。研究表明，一些snp突变会导致猫出现遗传性疾病。用于检测snp的方法很多，包括dna直接测序，扩增阻碍突变系统(amplification refractory mutation system，arms)等，其中dna直接测序为突变检测的金标准，但因其所需时间长、费用高，在检测中受到很大限制。

技术实现要素：

5.为了解决基因多态性的检测，本发明的目的在于提供一种基于荧光arms-pcr技术结合毛细管电泳检测基因突变的试剂盒，本试剂盒采用荧光pcr扩增(quantitive fluorescent pcr，qf-pcr)结合毛细管电泳检测的方法，扩增体系中对于每个检测位点设置普通引物和荧光引物，引物与对应的基因组dna模板结合并进行扩增，产生特定长度和荧光标记的扩增产物，扩增产物用毛细管电泳检测，通过不同的荧光标记片段大小、基因位点的产物峰高比值，确定样本基因型。
6.本发明中所述基因突变主要包括：点突变、缺失突变和插入突变。本发明中所述缺失突变可以包括缺失一个或多个碱基的突变，同样的所述插入突变可以包括插入一个或多个碱基的突变。
7.本发明整合了arms-pcr技术和毛细管电泳检测技术。本发明的特征在于，在相同体系中，使用本发明的针对野生型模板arms引物和针对突变型模板arms引物与所述的arms引物对应的上游或下游引物，用一个反应管实现对同一份待测样本的10个snp进行检测，通过片段大小、基因位点的产物峰高比值，确定样本的基因型。
8.本发明依据arms-pcr技术原理，进行了增加arms引物3’端区域的错配碱基，使得野生型arms引物对突变样本不扩增或扩增效率很低；并且针对突变型模板的arms引物对野生型样本不扩增或扩增效率很低，增强引物的特异性，使得结果更易于判断。
9.本发明所述试剂盒针对点突变，所述试剂盒包括：针对野生型模板的arms引物，所述引物的3’末端终止在待测位点处并且与野生型序列匹配，在野生型arms引物3’端第2-4碱基的位置增加错配碱基；
10.针对突变型模板的arms引物，所述引物的3’末端终止在待测位点处并且与突变型序列匹配，在突变型arms引物3’端第2-4碱基的位置增加错配碱基、且在突变型arms引物5’末端增加4个碱基；
11.共用上游或下游荧光引物，所述荧光引物与野生型arms、突变型arms引物一起扩增一段包含待测基因突变位点的序列；
12.本发明所述试剂盒针对插入或缺失突变，所述试剂盒包括：设计一对普通扩增引物，在引物上游或下游5’末端增加荧光修饰，通过毛细管电泳检测，根据片段大小用于区分待测样本分型。
13.本发明中，所述试剂盒进一步包括：2.5
×
master mix(主要组成成分：dntps、聚合酶、mg2+等)、dna质控品1(野生型模板)、dna质控品2(突变型模板)、无核酸酶纯水和毛细管电泳检测内标qd550。
14.本发明所述试剂盒中，对所述荧光引物5’末端进行荧光标记，例如对所述引物进行5’末端fam或hex标记。
15.本发明的另一个目的，基于荧光arms-pcr方法结合毛细管电泳检测技术，开发了一管同时检测10个snp突变位点的方法。所述方法包括：在反应体系中(包括样本dna，2.5
×
master mix，无核酸酶纯水)，使用本发明的引物混合液对同一份待测样本进行检测，通过不同的荧光标记片段大小、基因位点的产物峰高比值，确定样本的10个snp基因型。
16.本发明的技术方案设计思路：
17.(1)arms引物设计：所述的引物采用primer premier5和ncbi blast等软件设计而成，设计引物时应尽量确保各引物的tm值在(60
±
2)℃的范围内，扩增效率类似并确保各对引物的扩增产物大小相差10bp以上。设计完成后，用autodimer等软件分析引物二聚体和不同引物之间的相互作用，如果有相互作用可产生非特异产物或二聚体的需要重新设计，直至得到符合要求的引物序列。
18.(2)选用猫口腔拭子提取的dna及参考品作为模板，分别用上述10对引物进行单重扩增，通过毛细管电泳结果来调整pcr体系及扩增条件以得到10对引物共同的扩增条件。通过多轮调整，综合体系均衡性、效率以及杂峰情况，体系在59度时，扩增效果最佳，故选择59度作为本试剂盒扩增的退火温度。
19.(3)构建复合体系：将10对引物按照同等比例的引物量置于同一管中扩增，再根据复合扩增的毛细管电泳结果来调整各自的浓度，使各引物对的扩增效率(反应在电泳结果的峰高上)基本一致且同一个snp位点检测结果无杂峰干扰，如果有引物满足不了上述条件，则重新设计引物。最终确定10对arms引物序列。
20.(4)性能研究：选取试剂盒扩增检测筛选出的突变样本，用金标准sanger测序法对样本进行扩增测序，与本试剂盒检测结果进行对比，对试剂盒的检测结果进行验证，确认试剂盒的准确性。
21.(5)阳性判断值：选择部分代表性分型样本用“金标准”方法(测序)，判定样本各位点基因分型；本试剂盒按照标准实验流程进行检测，试剂盒结果与“金标准”结果比对；试剂
盒检测结果使用excel进行统计分析，确定片段大小和峰高范围，使用spss 18.0绘制受试者工作特征(roc)曲线确定峰高比值范围和重组样本有效峰范围即结果判读标准。
22.根据roc曲线结果，确定野生型/插入型与杂合型的峰高比值的分界值为5.12，纯合突变型/缺失型与杂合型的峰高比值的分界值为0.11，确定分型阈值参数，如下表所示。
23.分型阈值参数
24.ratio样本分型《0.11纯合突变型/缺失型0.11～5.12杂合型》5.12野生型/插入型
25.(6)最低检出限：本研究对猫口腔拭子提取的基因组dna进行浓度梯度稀释，每个浓度水平重复检测3次，以100％可检出的最低浓度作为最低检出限。分别以0.2ng/μl、0.5ng/μl、1ng/μl三个浓度梯度的样本进行扩增测试，利用abi 3500xl dx对扩增产物进行检测，摸索猫snp检测试剂盒的检测灵敏度。为保证后续95％以上的检出率，最终将dna的样本最低检出限定为0.5ng/μl。
26.(7)重复性验证：利用上述试剂盒对1.5ng/μl的样本进行重复扩增测试，使用abi 3500xl dx对扩增产物进行检测，测试该试剂盒的重复性。通过实验数据分析，3次重复中各个snp位点的峰型均能清晰检测，且分型一致，故可判断该试剂盒具有良好的重复性。
27.(8)利用abi 9700、abi veriti 96及abi veriti dx 96pcr扩增仪对猫snp检测试剂盒进行扩增测试，分别利用abi 3500xl dx、abi 3730基因检测仪对产物进行检测，探究猫snp检测试剂盒的适用机型。通过数据分析，abi9700的扩增效率略高于abi verti 96及abi verti dx 96，abi 3500xl dx的检测效率略高于abi 3730；表明体系在abi 9700、abi verti 96及abi verti dx 96条件下均能正常扩增，性能不受扩增仪器的影响，扩增产物在3500xl dx、abi 3730上均能清晰检测出，不同仪器的检测结果一致。
28.(9)稳定性研究：将试剂盒-20℃
±
5℃以下避光保存时间至试剂完全冷冻，再进行下一次融化和冷冻过程。采取对本试剂盒进行反复冻融，并通过扩增检测样本，分析各样本在试剂盒不同次反复冻融情况下的检测结果情况，以此来评估试剂盒反复冻融次数限制。本试剂盒在反复冻融0、2、4、5、6次后，使用每次冻融试剂盒对14例样本分别重复3次扩增检测，重复检测结果均一致，且5次冻融结果均一致，冻融6次后，检测结果无异常，均能够正常分型，故本试剂盒反复冻融6次后仍可有效扩增检测样本。
29.(三)有益效果
30.本发明提供了一种猫遗传病snp位点检测试剂盒。具备以下有益效果：
31.本试剂盒采用荧光pcr扩增(quantitive fluorescent pcr，qf-pcr)结合毛细管电泳检测的方法，扩增体系中对于每个检测位点设置普通引物和荧光引物，引物与对应的基因组dna模板结合并进行扩增，产生特定长度和荧光标记的扩增产物。扩增产物用毛细管电泳检测，通过不同的荧光标记片段大小、基因位点的产物峰高比值，确定样本基因型，含有5项猫常见遗传病位点，基本涵盖市场上主流检测位点；模板适用范围广，如血液、口腔拭子、脐带及其他猫组织样本均能检测；系统特异性、稳定性、准确性好，经过反复验证，信号强度稳定；灵敏度高，低至0.5ng/μl的dna模板量可以得到准确分型。
附图说明
32.图1试剂盒质控品1扩增结果
33.图2试剂盒质控品2扩增结果
34.图3试剂盒最低检出限fam通道扩增结果
35.图4试剂盒最低检出限hex通道扩增结果
36.图5重复性验证fam通道扩增结果
37.图6重复性验证hex通道扩增结果
38.图7abi 9700扩增质粒dna het检测结果
39.图8abi veriti 96扩增质粒dna het检测结果
40.图9abi veriti dx 96扩增质粒dna het检测结果。
具体实施方式
41.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
42.实施例1应用一种猫遗传病snp位点检测试剂盒扩增猫口腔拭子提取的基因组dna质控品1
43.(1)采集猫口腔拭子
44.(2)dna提取：采用天根“高效口腔拭子基因组dna提取试剂盒”制备dna。
45.(3)反应体系：将各反应试剂(2.5
×
master mix、引物混合液、无核酸酶纯水)震荡混合后按照体积比(模板除外)配置pcr反应混合液，分装9μl于pcr反应管中，最后往各反应管加入1μl模板，离心后进行下一步。反应体系组成见下表。
46.标准扩增反应体系
47.组分名称体积(μl)2.5
×
master mix8引物混合液2无核酸酶纯水9dna模板1总体积20μl
48.(4)pcr反应程序：将pcr反应管置于扩增仪上，设计并运行如下程序：第1步：95℃变性5分钟，第2步：97℃变性10秒，第3步：59℃退火30秒，第4步：72℃延伸30秒，重复2至4步30次，最后72℃延伸10分钟。pcr程序运行完毕后，pcr产物可立即进行后续检测；或2～8℃保存，24小时内检测；或-20℃保存，三天内检测。请尽量避免反复冻融，或冻融次数不超过3次
49.(5)毛细管电泳检测：将qd550内标和甲酰胺按照比例2.5:100混合，取12.5μl混合物加到96孔板里，再加入扩增产物样品1μl，混合静置数分钟，95℃变性3分钟，立即冰浴3分钟，离心后放入abi3730测序仪上，准备检测。
50.(6)数据分析：导入原始数据，在主页面的file菜单选择add sample to project，
找到样本文件，选中文件夹，点击add to list，点击add，样本文件即显示在project窗口，选择分析参数。定义analysis method、panel和size standard。在主页面菜单选择analysis》analysis selected sample，出现save project对话框，命名后保存，软件即开始处理数据，分析完成后左下角显示analysis completed。采用genemapper软件分析得到的数据并生成图谱，见图1。
51.实施例2：应用一种猫遗传病snp位点检测试剂盒扩增突变型质粒，即试剂盒里质控品2，突变型质粒是一段包含突变位点的dna序列，由上海生物工程股份有限公司合成。
52.(1)按照实施例1中的扩增条件进行pcr扩增
53.(2)按照实施例1中在遗传分析仪上进行检测，采用genemapper软件分析得到的数据并生成图谱，见图2
54.以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
55.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

技术特征：
1.一种猫遗传病snp位点检测试剂盒，其特征在于：所述snp位点针对点突变，所述试剂盒包括：设置野生型模板的arms引物，所述引物的3’末端终止在待测位点处并且与野生型序列匹配，其中在所述引物的3’端第2-4位设置一个错配碱基；设置突变型模板的arms引物，所述引物的3’末端终止在待测位点处并且与突变型序列匹配，其中在所述引物的3’端第2-4位设置一个错配碱基，在5’末端增加4个碱基区分片段长度；共用一条上游荧光引物，所述荧光引物与所述针对野生型模板的arms引物和所述针对突变型模板的arms引物一起扩增一段包含待测基因突变位点的序列，产生特定长度和荧光标记的扩增产物。扩增产物用毛细管电泳检测，通过片段大小、基因位点的产物峰高比值，确定样本的基因型。2.根据权利要求1所述一种猫遗传病snp位点检测试剂盒，其特征在于：所述snp位点针对插入或缺失突变，所述试剂盒包括：设计一对扩增引物，在引物的正向或反向5’末端加上荧光标记，所述引物一起扩增一段包含待测基因突变位点的序列，产生特定长度和荧光标记的扩增产物。扩增产物用毛细管电泳检测，通过片段大小、基因位点的产物峰高比值，确定样本的基因型。3.根据权利要求1所述一种猫遗传病snp位点检测试剂盒，其特征在于：10个snp位点引物序列分别为：扩增多囊肾病pkd1(c.9882c>a)的野生型引物pkd1-wr如seq id no1所示；扩增多囊肾病pkd1(c.9882c>a)的突变型引物pkd1-mr如seq id no2所示；扩增多囊肾病pkd1(c.9882c>a)的共用引物pkd1-f如seq id no3所示，5'fam修饰；扩增渐进性视网膜萎缩kif3b(c.1000g>a)的野生型引物kif3b-wr如seq id no4所示；扩增渐进性视网膜萎缩kif3b(c.1000g>a)的突变型引物kif3b-mr如seq id no5所示；扩增渐进性视网膜萎缩kif3b(c.1000g>a)的共用引物kif3b-f如seq id no6所示，5'hex修饰；扩增渐进性视网膜萎缩cep290(ivs50+9t>g)的野生型引物cep290-wf如seq id no7所示；扩增渐进性视网膜萎缩cep290(ivs50+9t>g)的突变型引物cep290-mf如seq id no8所示；扩增渐进性视网膜萎缩cep290(ivs50+9t>g)的共用引物cep290-r如seq id no9所示，5'fam修饰；扩增肥厚型心肌病mybpc3(c.91g>c)的野生型引物mybpc3-91-wf如seq id no10所示；扩增肥厚型心肌病mybpc3(c.91g>c)的突变型引物mybpc3-91-mf如seq id no11所示；扩增肥厚型心肌病mybpc3(c.91g>c)的共用引物mybpc3-91-r如seq id no12所示，5'fam修饰；扩增肥厚型心肌病mybpc3(c.2458c>t)的野生型引物mybpc3-2458-wf如seq id no13所示；扩增肥厚型心肌病mybpc3(c.2458c>t)的突变型引物mybpc3-2458-mf如seq id no14所示；
扩增肥厚型心肌病mybpc3(c.2458c>t)的共用引物mybpc3-2458-r如seq id no15所示，5'hex修饰；扩增肥厚型心肌病myh7(c.5647g>a)的野生型引物myh7-wr如seq id no16所示；扩增肥厚型心肌病myh7(c.5647g>a)的突变型引物myh7-mr如seq id no17所示；扩增肥厚型心肌病myh7(c.5647g>a)的共用引物myh7-f如seq id no18所示，5'fam修饰；扩增肥厚型心肌病tnnt2(c.95intron(-108)g>a)的野生型引物tnnt2-wf如seq id no19所示；扩增肥厚型心肌病tnnt2(c.95intron(-108)g>a)的突变型引物tnnt2-mf如seq id no20所示；扩增肥厚型心肌病tnnt2(c.95intron(-108)g>a)的共用引物tnnt2-r如seq id no21所示，5'hex修饰；扩增肥厚型心肌病alms1(c.7384g>c)的野生型引物alms1-wr如seq id no22所示；扩增肥厚型心肌病alms1(c.7384g>c)的突变型引物alms1-mr如seq id no23所示；扩增肥厚型心肌病alms1(c.7384g>c)的共用引物alms1-f如seq id no24所示，5'hex修饰；扩增丙酮酸激酶缺乏症pklr(c.682_694delgtgcagaaaatcg(old:c.693+304g>a))的引物pklr-f如seq id no25所示，5'fam修饰；扩增丙酮酸激酶缺乏症pklr(c.682_694delgtgcagaaaatcg(old:c.693+304g>a))的引物pklr-r如seq id no26所示；扩增甘露糖苷贮积症man2b1(c.1749_1752delccag)的引物man2b1-f如seq id no27所示，5'hex修饰；扩增甘露糖苷贮积症man2b1(c.1749_1752delccag)的引物man2b1-r如seq id no28所示。4.根据权利要求1所述一种猫遗传病snp位点检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括2.5
×
master mix，且主要组成成分：dntps、dna质控品野生型模板、dna质控品突变型模板、无核酸酶纯水和毛细管电泳检测内标qd550。5.根据权利要求1所述一种猫遗传病snp位点检测试剂盒，其特征在于：所述扩增体系：8μl的2.5
×
master mix、2μl的引物混合液、9μl的无核酸酶纯水、1μl的待检dna模板或1μl的质控品1、2；所述扩增体系反应条件：95℃预变性5分钟；97℃变性10秒，59℃退火30秒，72℃延伸30秒，共30个循环；72℃延伸10分钟。6.根据权利要求1所述一种猫遗传病snp位点检测试剂盒，其特征在于：所述毛细管电泳检测反应体系：8.8μl hi-di、0.2μl qd550内标、1μlpcr产物原液，盖上胶垫，使用台式或板式离心机，瞬时离心；反应条件：95℃变性5min，然后立刻-20℃冰浴5min以上，24小时内检测，检测前使用台式或板式离心机，瞬时离心，使用基因分析仪进行毛细管电泳检测，选择“fragment”电泳方法。

技术总结
本发明涉及一种猫遗传病SNP位点检测试剂盒，涉属于生物技术领域，利用荧光ARMS-PCR方法结合毛细管电泳检测技术，开发了一种同时检测10个SNP位点的荧光试剂盒，用于体外定性检测猫口腔拭子基因组DNA中与猫五项高发遗传病相关的10个SNP位点；模板适用范围广，如血液、口腔拭子、脐带及其他猫组织样本均能检测；系统特异性高、稳定性好、准确率高；经过反复验证，信号强度稳定；灵敏度高，低至0.5ng/μL的DNA模板量即可以得到准确分型。DNA模板量即可以得到准确分型。DNA模板量即可以得到准确分型。

技术研发人员：李尚桐 郎丹丹 陈拼
受保护的技术使用者：北京格致博雅生物科技有限公司
技术研发日：2022.12.08
技术公布日：2023/3/10

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