鉴别环颈雉来源的方法

本发明属于动物检测，具体涉及一种基于甲基化敏感性高分辨率熔解技术(ms-hrm)量化环颈雉骨骼肌(胸大肌、臂三头肌、腓肠肌、股二头肌、颈升肌)差异基因位点的甲基化率，达到鉴别野生和圈养环颈雉的方法。

背景技术：

1、我国拥有世界上规模最大、种类最多、市场最活跃的野生动物养殖体系，约有100多个物种实现了人工养殖和合法利用，包括药用、毛皮、观赏、伴宠等用途。但野外种群受到《中华人民共和国野生动物保护法》和相应地方法规的保护，禁止或限制捕猎和商业化利用。因此，一些非法猎捕的野生动物在市场上经常以人工养殖动物的名义售卖，以获得非法利益，逃避法律责任。执法实践中有70％的案件需要鉴别涉案动物来源于野外还是养殖场。但是至今还缺乏直接进行科学鉴定的方法，只能通过“野生动物繁育利用标识”制度所包含的审批手续等间接证明动物来源。环颈雉是列入《中国畜禽资源目录》的食用鸟类，得到大规模饲养，而其野外种群被列为“三有”动物而受到法律的保护，在保护实践中来源鉴定需求较大。

2、肌肉是环颈雉利用的主要部位，而肌肉作为代谢率很高的组织，其蛋白、脂肪酸、微量元素、稳定同位素等组成随环境的更新速度很快，且地域性明显，只能在特定条件下用于动物来源的鉴别。因此迫切需要建立一套操作简单、高准确率、低成本的鉴别肌肉产品来源的方法。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术中的不足，目的是提供一种鉴别环颈雉来源的方法。

2、为达到上述目的，本发明的解决方案是：

3、一种鉴别环颈雉来源的方法，其包括如下步骤：

4、(1)提取野生环颈雉和圈养环颈雉不同骨骼肌差异显著的基因位点；

5、(2)针对基因位点进行甲基化敏感性高分辨率熔解检测，并验证甲基化位点；

6、(3)设计相应的引物进行pcr扩增；

7、(4)构建不同引物的甲基化率标准曲线，以及样本甲基化tm值得到差异甲基化位点，获得各位点的单点判别力和联合判别力；

8、(5)通过野生和圈养之间的差异达到鉴别环颈雉的来源。

9、进一步地，步骤(1)中，骨骼肌包括胸大肌、臂三头肌、腓肠肌、股二头肌、颈升肌。

10、进一步地，步骤(2)中，甲基化位点包括loc116231076、loc116242223、loc116232884、atad2b、egfl6、hs2st。

11、进一步地，步骤(3)中，loc116231076的上游引物序列为seq id no.1，下游引物序列为seq id no.2；

12、loc116242223的上游引物序列为seq id no.3，下游引物序列为seq id no.4；

13、loc116232884的上游引物序列为seq id no.5，下游引物序列为seq id no.6；

14、atad2b的上游引物序列为seq id no.7，下游引物序列为seq id no.8；

15、egfl6的上游引物序列为seq id no.9，下游引物序列为seq id no.10；

16、hs2st的上游引物序列为seq id no.11，下游引物序列为seq id no.12。

17、进一步地，步骤(3)中，pcr扩增的条件为：

18、预变性阶段：95℃预变性2min；随后进入循环扩增阶段：95℃预变性10s、最佳退火温度退火20s、72℃延伸30s，整个扩增阶段循环40次。

19、进一步地，步骤(5)中，差异为标准曲线、判别力、重复性和灵敏度的不同数值。

20、由于采用上述方案，本发明的有益效果是：

21、本发明提供一种利用ms-hrm技术定量检测环颈雉不同骨骼肌差异基因位点的甲基化率，即基于wgbs下机数据和ms-hrm技术所建立的一套筛选甲基化检测位点的方法学流程，通过在野生和圈养两组之间的差异达到鉴别环颈雉来源的方法，可应用于更多动物甲基化差异位点的筛选。

22、本发明操作简便、通量高、成本低、耗时少、高效且适用范围广——采用配有hrm分析模块的荧光定量pcr仪，一次可以同时检测90例样本，通量高，耗时少。本发明不仅是鉴别野生和圈养环颈雉的方法，也为建立其它动物的同类鉴定方法提供借鉴。

技术特征：

1.一种鉴别环颈雉来源的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的鉴别环颈雉来源的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述骨骼肌包括胸大肌、臂三头肌、腓肠肌、股二头肌、颈升肌。

3.根据权利要求1所述的鉴别环颈雉来源的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述甲基化位点包括loc116231076、loc116242223、loc116232884、atad2b、egfl6、hs2st。

4.根据权利要求1或3所述的鉴别环颈雉来源的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述loc116231076的上游引物序列为seq id no.1，下游引物序列为seq id no.2；

5.根据权利要求1所述的鉴别环颈雉来源的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述pcr扩增的条件为：

6.根据权利要求1所述的鉴别环颈雉来源的方法，其特征在于，步骤（5）中，所述差异为标准曲线、判别力、重复性和灵敏度的不同数值。

技术总结
本发明提供了一种鉴别环颈雉来源的方法，其包括如下步骤：提取野生环颈雉和圈养环颈雉不同骨骼肌差异显著的基因位点；针对所述基因位点进行甲基化敏感性高分辨率熔解检测，并验证甲基化位点；设计相应的引物进行PCR扩增；构建不同引物的甲基化率标准曲线，以及样本甲基化Tm值得到差异甲基化位点，获得各位点的单点判别力和联合判别力；通过野生和圈养之间的差异达到鉴别环颈雉的来源；本发明提供一种利用甲基化敏感性高分辨率熔解技术定量检测环颈雉不同骨骼肌差异基因位点的甲基化率，通过在野生和圈养两组之间的差异达到鉴别环颈雉来源的方法，可应用于更多动物甲基化差异位点的筛选。

技术研发人员：徐艳春,王文慧,张琦,于梦佳,陈晓琳
受保护的技术使用者：东北林业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15

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