一种含有胆汁酸的复合菌剂在用于制备防治宠物脂肪肝的制剂中的应用的制作方法

1.本发明属于宠物养殖技术领域，具体涉及一种含有胆汁酸的复合菌剂在用于制备防治宠物脂肪肝的制剂中的应用。
技术背景
2.脂肪肝是宠物比较常见的肝脏疾病，往往是应激后绝食导致的。当宠物身体的糖原消耗殆尽时，身体开始动用脂肪供能，但是宠物的肝脏天生不善于利用脂肪，当大量脂肪涌入肝脏的时候，很容易引发肝脏脂肪沉积，由此形成了脂肪肝。发病的宠物此时会进一步绝食，开始出现呕吐，精神沉郁的状况，严重的甚至会出现肝脑病抽搐的症状，如不及时干预，会引起宠物的死亡。另外，宠物常见的三联体炎症：肝炎、肠炎、胰腺炎，也会诱发宠物脂肪肝的发生。
3.目前，针对于宠物的脂肪肝的治疗，主要有3种方式：营养支持，通过插食管、胃造瘘置管术等方法保证宠物日常的营养需求；药物疗法，使用水飞蓟宾、l
‑
肉毒素、磷酸盐等促进脂肪氧化、保护宠物肝脏；液体疗法，使用多离子晶体液、林格氏液等维持宠物体内的电解质平衡。在临床实践中，需要根据宠物的自身情况和脂肪肝严重程度来设计治疗方案，治疗过程繁琐、颇为考验医生的临床经验，且效果并不十分明显，同时药物也会给宠物的肝脏带来一定的损伤。因此，十分需要一种使用简单、效果好且无副作用的产品来解决宠物脂肪肝问题。

技术实现要素：

4.本发明提供了一种含有胆汁酸的复合菌剂在用于制备防治宠物脂肪肝的制剂中的应用。所述复合菌剂安全可靠，能够有效解决宠物的脂肪肝问题。
5.为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
6.本发明提供了一种含有胆汁酸的复合菌剂在用于制备防治宠物脂肪肝的制剂中的应用。
7.进一步的，所述复合菌剂包括多形拟杆菌菌粉、胆汁酸和多苞桉桉树精油。
8.进一步的，所述复合菌剂中多形拟杆菌菌粉、胆汁酸和多苞桉桉树精油的质量比为2
‑
3∶2
‑
3∶1。
9.进一步的，所述多形拟杆菌菌粉是由保藏编号为cgmcc no.20818的多形拟杆菌gl
‑
02通过培养发酵干燥制得的。
10.进一步的，所述多形拟杆菌菌粉的制备方法为：将多形拟杆菌gl
‑
02挑取至gam液体培养基中，35℃厌氧环境下活化48h，将得到的活化菌液取1ml再次接种到50ml gam液体培养基中培养24
‑
76h，将培养液10000rpm/min离心5min后，将菌株沉淀物用其质量10
‑
12倍体积的无菌生理盐水重悬，再次10000rpm/min离心5min，使用其质量5倍体积的无菌生理盐水二次重悬；然后选择脱脂牛奶作为保护剂，并利用真空冷冻干燥法制备成多形拟杆菌gl
‑
02菌粉。
11.进一步的，所述多形拟杆菌gl
‑
02菌重悬液的菌含量不小于1
×
109cfu/ml。
12.进一步的，所述复合菌剂的菌含量不少于5
×
108cfu/g。
13.进一步的，所述复合菌剂的使用方法为：将所述复合菌剂以每日3
‑
8g的用量均匀混合在宠物的饲料或引用水中，或者直接给宠物口服使用，连续使用14
‑
30天。
14.优选的，所述复合菌剂的使用方法为：将所述复合菌剂以每日4
‑
6g的用量均匀混合在宠物的饲料或引用水中，或者直接给宠物口服使用，连续使用25
‑
30天。
15.进一步的，所述复合菌剂能够显著降低宠物的总胆红素、谷丙转氨酶、谷氨酰转肽酶和碱性磷酸酶。
16.进一步的，所述复合菌剂能够显著抑制宠物由脂肪肝而引起的总胆红素、谷丙转氨酶、谷氨酰转肽酶和碱性磷酸酶的上升，并恢复至正常值。
17.进一步的，所述复合菌剂能够显著减少宠物肝脏脂肪的体积。
18.进一步的，所述复合菌剂能够促进宠物食欲和精神的恢复。
19.进一步的，所述宠物包括宠物犬和宠物猫。
20.进一步的，所述宠物猫包括蓝猫和加菲猫。
21.本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
22.本发明从分离出一株多形拟杆菌gl
‑
02，该菌不会对动物人体造成伤害，也不会影响环境；本发明利用多形拟杆菌gl
‑
02菌粉与胆汁酸、多苞桉桉树精油制备成一种全新的复合菌剂。所述复合菌剂制备简单、用料安全，能够通过加快宠物肝脏脂肪的氧化和分解而加速宠物肝脏脱脂过程，从而抑制肝脏脂肪的沉积，治疗和有效的预防宠物脂肪肝的形成，还可以恢复肝脏、血液等指标恢复正常，并促进胆红素的排泄，帮助宠物恢复食欲和精神，进而有效解决宠物的脂肪肝问题。本发明的复合菌剂无副作用、使用安全且效果好，使用时不会产生宠物无法接受的异味，有利于喂药，进而促进宠物的生长和发育。
附图说明
23.图1为所述多形拟杆菌gl
‑
02的菌落图片。
24.图2为复合菌剂对蓝猫格鲁特肝脏的影响；上图为使用复合菌剂前；下图为使用复合菌剂后。
25.图3为复合菌剂对加菲猫胖胖精神状态的影响；左图为使用复合菌剂前；右图为使用复合菌剂后。
具体实施方式
26.以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
27.实施例1：
28.1、多形拟杆菌gl
‑
02的筛选
29.取10g健康猪粪便和100ml无菌水混匀，过滤去除杂质后制成粪便稀释液，然后继续向稀释液中添加无菌水，制备成10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5稀释液；再分别取10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5稀释液涂布至gam琼脂培养基中，在含有80％n2、10％co2和10％h2的厌氧环境下，35
℃培养48h，选取明显的菌落进行多次纯化后得到单菌落，将得到的单菌落命名为gl
‑
02，冷冻保藏。其中，gam琼脂培养基配方为：10.0g蛋白胨，3.0g大豆胨，10.0g月示胨，13.5g血清消化粉，2.2g牛肉浸粉，5.0g酵母浸粉，1.2g牛肝浸粉，3.0g葡萄糖，3.0g氯化钠，2.5g磷酸二氢钾，5.0g可溶性淀粉，0.3g l
‑
半胱氨酸，0.15g硫乙醇酸钠，15.0g琼脂，1ml 0.1％维生素k1溶液，3ml氯化血红素溶液，100mg卡那霉素，1000ml蒸馏水，ph 7.1。
30.如图1所示，所述菌株gl
‑
02在gam琼脂培养基上的菌落呈圆形或类圆形，黄色，直径0.5
‑
2.5mm，表面光滑无光泽，中间微凸，不透明，边缘较整齐。
31.2、多形拟杆菌gl
‑
02的鉴定
32.提取所述菌株gl
‑
02的基因组dna，并以此为模板，使用16s rrna通用引物进行pcr扩增，获得16s rrna扩增序列后测序，然后将该序列进行blast比对，结果显示菌株gl
‑
02与genbank基因库中的多形拟杆菌bacteroides thetaiotaomicron同源性最高，因此判定菌株gl
‑
02为多形拟杆菌。
33.将筛选到的多形拟杆菌gl
‑
02进行菌种保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2020年09月25日；多形拟杆菌bacteroides thetaiotaomicron的保藏编号为cgmcc no.20818。
34.3、多形拟杆菌gl
‑
02菌粉的制备
35.将保存的多形拟杆菌gl
‑
02挑取至gam液体培养基(在gam琼脂培养基配方上减少琼脂即可)，35℃厌氧环境下活化48h，将得到的活化菌液取1ml再次接种到50ml gam液体培养基中培养24
‑
76h，将培养液10000rpm/min离心5min后，将菌株沉淀物用其质量10
‑
12倍体积的无菌生理盐水重悬，再次10000rpm/min离心5min，使用其质量5倍体积的无菌生理盐水二次重悬，此时要确保重悬液中多形拟杆菌gl
‑
02的菌含量不小于1
×
109cfu/ml；然后选择脱脂牛奶作为保护剂，并利用真空冷冻干燥法制备成多形拟杆菌gl
‑
02菌粉。
36.实施例2：复合菌剂的制备
37.1、胆汁酸的制备
38.所述胆汁酸的制备工艺步骤如下：
39.(1)皂化：将粉碎过40目筛的1kg猪胆粉加入反应釜中，再加入质量浓度为10％的氢氧化钠溶液10l，加热搅拌至沸腾，并保持沸腾状态搅拌14h，然后将反应生成的皂化液冷却至固液分层，去除上清液，剩余固体即为胆汁酸皂化品；
40.(2)脱色：向胆汁酸皂化品中加6l水，加热至80℃使胆汁酸皂化品完全溶解，然后将其打入脱色罐中，加入300ml双氧水搅拌均匀后，常温反应24h，然后将反应溶液过滤至酸化槽中，得到滤液；
41.(3)酸化：将滤液冷却至室温，缓慢加入10％盐酸溶液，边加入边搅拌，待溶液ph值在3时停止加酸，离心过滤得到白色固形物；
42.(4)纯化：将白色固形物不断加水冲洗，将附着在白色固形物表面的水溶性杂质去除，待滤出的水检测呈中性后结束水洗；将离心过滤后的白色固形物放入烘箱中，100℃干燥至水分少于10％，得胆汁酸粗品；
43.(5)重结晶：将胆汁酸粗品投入萃取罐中，加入胆汁酸粗品重量10倍体积的乙酸乙酯搅拌至完全溶解，再加入0.08g无水硫酸钠脱水，过滤收集过滤液，将过滤液进行减压浓
glu(mmol/l)7.79.86.36.13.9
‑
8.2na(mmol/l)149132156153147
‑
156k(mmol/l)3.81.84.34.12.4
‑
4.6cl(mmol/l)117102116112107
‑
120
57.实施例4
58.浙江省潮州市某动保宠物医院收治了一只5岁雄性加菲猫，名为胖胖。入院时，胖胖消瘦明显、出现流涎、精神沉郁的现象。据主人描述，是因为家中新来了一只猫咪，胖胖出现了应激表现，逐渐开始没有食欲，还出现呕吐、不爱活动、躲藏不动、精神消沉的现象。临床检查发现胖胖腹部皮肤出现黄染问题；血常规、全项生化、b超及felv/fiv病毒检测后发现(表2)，胖胖的总胆红素(t
‑
bil)、谷丙转氨酶(alt)和碱性磷酸酶(alkp)显著升高，felv/fiv病毒检测呈阴性，医生初步诊断胖胖患脂肪肝。
59.但由于胖胖的脾气比较暴躁，不喜欢吃药，强制喂药的应激性均很大，所以医生选择给胖胖使用本发明的复合菌剂，使用方法为：以每天6g的用量将复合菌剂混于胖胖的饮用水中给其服用，每天一次，并在治疗的前3天，同时给胖胖使用生理盐水来补充电解质，使用复合菌剂14天后，胖胖逐步恢复食欲，精神开始好转，再继续使用14天后，经血常规和生化检测，胖胖的各项指标基本恢复正常(表2)，尤其是t
‑
bil、alt和alkp显著降低，精神食欲完全恢复，可以自由玩耍了。由此说明，本发明的复合菌剂能够抑制肝脏脂肪沉积、促进胆红素排泄，能有效解决宠物的脂肪肝问题，且能够帮助宠物恢复食欲、使用无副作用。
60.表2使用复合菌剂对胖胖各项指标的影响
61.检测指标使用前使用后参考值范围alt(u/l)574
↑
12012
‑
130ggt(u/l)400
‑
4alb(g/dl)3.62.72.2
‑
4.0t
‑
bil(mg/dl)3.6
↑
1.00.0
‑
0.9alkp(u/l)176
↑
4614
‑
111chol(mg/dl)14412265
‑
225rbc(m/μl)7.707.266.54
‑
12.20hgb(g/dl)10.59.99.8
‑
16.2mcv(fl)37.839.535.9
‑
53.1mch(pg)13.613.611.8
‑
17.3mchc(g/dl)36.1
↑
34.528.1
‑
35.8rdw(％)23.123.515.0
‑
27.0retic(k/μl)2.3
↓
27.63.0
‑
50.0retic
‑
hgb(pg)12.5
↓
14.213.2
‑
20.8wbc(k/μl)10.7710.172.87
‑
17.02
62.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

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