PCR法检测犬细小病毒的研究

PCR法检测犬细小病毒的研究

犬细小病毒，（简称CPV）能引起犬的出血性坏死性肠炎及心肌炎。由于它的发病率和死亡率很高，并且康复犬也可能长期带毒，因此对实验犬，军犬，警犬危害极大。近年来已引起国内外有关学者的高度重视。目前国内对细小病毒的检测方法主要有病毒分离、血凝实验和电镜检查等等。电镜检查和病毒分离方法虽然特异性和敏感性较好，但是作为常规检测所耗时间太长，并且成本较高。血凝实验法又缺乏稳定性。本文以细胞培养物，病犬粪便样品为研究对象，进行PCR法检测犬细小病毒的研究。主要内容包括：一、培养猫肾F_(81)传代细胞，制作细胞爬片，感染犬细小病毒，分时段 收集细胞，固定后作为实验材料。二、苯酚法从染毒细胞中抽提DNA，用合成的两对引物进行PCR扩增， 通过优化PCR反应的各种条件，用两对引物都扩增出目的片段， 分别为1051bp和226bp，经过多次实验，结果稳定，所设阴性对照 无扩增带。三、经过对已知阳性粪便样品的实验，发现第二对引物，即扩增产物为 226bp的引物敏感性和稳定性更好。并且在已知阳性样品中，进行 PCR法与HA法的比较，实验结果经统计学软件SSPS 10.0 McNemar Test分析得出结论两种方法检验结果有显著性差异 （P＜0.05），PCR检出率更高，更敏感。四、在犬粪便样品中进行PCR检测方法的研究。我们又用第二对引物l 对从某宠物医院得到的临床初步诊断为犬细小病毒感染的20粪便lD 样品进行了检测，其中，阳性结果门个，阴性结果 7个。在 PCR Dl 扩增的同时，我们对样品进行血凝对照实验，结果 PCR法检测fill 阳性的 13个样品中 HA法只有 8个阳性，其余为阴性。我们将 PCRl 法检测为阳性而HA法检测为阴性的5个样品，经过处理后，感染lDfffi肾F。；传代细胞、其细胞病变特征与标准毒株感染细胞的病变特征DD 相同。Dl 五、在液相PCR法检测犬细小基础上，用接种病毒细胞爬片进行原位lIPCR检测方法的研究。实验采用直接法原位PCR将生物素标记在 lD 引物上，扩增产物用抗生物素碱性磷酸酶系统进行检测，成功地建Dl 立了直接原位 PCR检测犬细小病毒的方法。在接毒细胞中检测到 lD 大量阳性物质，阳性物质有些在细胞质中，有些在细胞核中，阴性DD 对照未曾检测到阳性物质。在接种病毒不同时期的细胞片上同时进DD 行原仿PCR和普通免疫组化对照检测实验。结果表明，用原位PCR Dl 方法在接毒 12小时到 72小时的细胞片上均检测到大量阳性细胞；ll 用普通免疫组化的方法，在接毒12小时的细胞片上未检测到阳性lD 细胞，在接毒24小时的细胞片上只见零星的阳性细胞。在接毒48 DD 小时的细胞片上，用阳性记分法将两种检测方法得到的阳性细胞进DD 行统计比较，差异显著o刃刀01人结果表明：原位P＊R方法既具l 有 PCR方法的敏感性，又具有组织定位的优越性，是值得推厂的 lD 研究病毒性感染疾病机理的一种先进的实验技术。D

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