华南地区常见药用蛇类的DNA条形码研究及其在金钱白花蛇鉴定上的应用

　　中药是中华民族的一大宝藏,在中国用于治疗疾病的历史已有数千年。中药来源于植物、动物、矿物三大类。动物药是中国医药宝库中重要的组成部分,具有悠久的应用历史。《中国药典》2005年版一部共收载药材553种,其中动物药53种,占9.6%,占可供药用动物资源的3.2%。我国利用蛇类的历史源远流长,可追溯至春秋战国时期。蛇类主要的利用方式为药用、食用和制革等。常见的药用种类有滑鼠蛇Ptyas mucosus、乌梢蛇Zaocys dhumnades、银环蛇Bungarus multicinctus、尖吻蝮Deinagkistrodon acutus等,食用的主要有灰鼠蛇Ptyas korros、滑鼠蛇、舟山眼镜蛇Naja atra等,用于制革的有王锦蛇Elaphe carinata等。而乌梢蛇、银环蛇和尖吻蝮蛇分别是药典收载的生药乌梢蛇、金钱白花蛇、蕲蛇的原动物,具有祛风、通络、止痉之功效,临床应用比较普遍。近年来,蛇的药用价值和经济价值明显提高,社会需求持续上升。随着蛇类野生资源逐渐匮乏,加上价格昂贵,药材市场上出现伪品及混淆品的数量甚多,质量问题严重,仅根据外部形态特征很难进行准确地鉴别。此外由于蛇类本身繁殖能力不强,加之生态环境易遭破坏,偷猎、走私与滥用导致多种蛇类特别是濒危蛇类的生存受到威胁。对蛇的准确鉴定,不仅能准确的鉴别药材正品来源与混伪品,保证用药的安全有效,也是加强蛇类资源保护与管理的首要环节。因此,建立快速、准确的鉴定方法具有重要意义。蛇类药材的混淆品屡见不鲜,鉴别方法也不断发展,除了传统的四大鉴别方法(基源鉴别、性状鉴别、显微鉴别和理化鉴别),许多新的鉴别技术和先进仪器被引入蛇类药材的鉴别之中。DNA条形码(DNA barcoding)技术是分子鉴定的最新发展,近年来在物种鉴定方面得到了迅速的发展和应用。DNA条形码技术简便高效,操作流程简单,而且不受样品的形态性状以及研究者的专业水平限制,尤其适用于来源于生物体部分组织或器官的中药材的真伪鉴定。中药DNA条形码分子鉴定在近几年得到快速发展,加快了中药鉴定标准化的进程。目前,动物DNA条形码技术最常用的基因片段是COI基因。国内已有用基于COI片段的DNA条形码对动物药鳖甲、鹿茸的鉴别应用进行了探索,均表明了其有效性。因此,我们收集了国内常见药用蛇类,探讨应用COI条形码对蛇类识别鉴定的可行性,并分析物种间的亲缘关系。一.华南地区常见药用蛇类的DNA条形码研究1.目的本文拟收集华南地区常见药用蛇类20余种,建立华南地区常见药用蛇类的DNA条形码数据库,用于生药样品鉴定并分析物种间的亲缘关系。2.方法2.1标本采集从广东、广西、湖南等地采集和收集蛇类物种共3科23种蛇44个样品。经华南濒危动物研究所张亮鉴定,所有蛇类标本均固定保存在95%酒精中,组织置于-20。冰箱保存。本研究结合实验样本及GenBank数据进行分析。2.2引物设计采用引物设计软件Primer Premier5,设计对蛇类物种COI序列能有效扩增的引物。2.3DNA的提取及COI序列扩增1)采用动物基因组提取试剂盒对采集的动物标本提取总DNA,用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测模板质量；2)对所提取的DNA的COI序列进行扩增,引物采用自行设计的双引物扩增。引物序列为：DK1-CO1:5-'CAACTAACCACAAAGACATCGG'-3; DK1-CO2:5-'CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA'-3.反应体系25μl：包括模板DNA、正反引物(20umol/l)各1μl, mix酶12.5μl,双蒸水9.5μl。扩增程序：93℃预变性5min,53℃2min,循环35次,依次为93℃变性30s,53℃退火45s,70℃延伸45s,最后在70℃延伸补齐5min。2.4PCR扩增产物回收纯化及测序PCR产物用1.2%琼脂糖电泳检测后,置于紫外灯下进行呈像,然后用琼脂糖凝胶回收试剂盒(Axygen)回收。PCR产物经纯化后,由上海英俊工程有限公司测序,各样品均采用正向和反向双向测序。2.5序列比对及分析利用BioEdit and Clustal X等软件对测序所得序列进行排序比对并辅以手工校正,获得长度为658bp的样品序列,在GenBank中进行相似性检索。排序后的序列使用MEGA5.0分子进化遗传分析软件,采用K-2p (Kimura2-parameter)计算遗传距离,用邻接法(neighbor joining method)构建系统聚类树,系统树各分支的置信度用自举检验法(bootstrap test),检验各分支的支持率,共进行1000次循环。3.结果3.1碱基组成与变异位点结果显示,51条蛇类编码的658个排列位点中,变异位点277个,A、T、C、G碱基平均含量分别为26.7%、28.1%、29.1%、16.1%。其中A+T含量(54.8%)明显高于G+C含量(45.2%)。3.2物种遗传距离分析种内遗传距离值范围为0-0.0409,最大的种内遗传距离值出现在乌梢蛇,其次是黄链蛇,为0.0377。种间遗传距离值范围为0.0850-0.2568。种间差异净值的最小值出现在东川白环蛇与黑背白环蛇之间,为8.5%,最大值出现在舟山眼镜蛇与三索锦蛇之间,达到了25.68%。最小种间遗传距离为0.0850,种间平均遗传距离为0.1943。银环蛇的种内遗传距离最大值为0.0185,乌梢蛇为0.0409,尖吻蝮蛇为0.0232。银环蛇与其余物种的种间遗传距离值范围为0.1797-0.2488,乌梢蛇为0.1581-0.2375,尖吻蝮蛇为0.1528-0.2488。其种间距离最小值均远远大于其种内遗传距离最大值。3.3系统发生树的构建基于COI序列,通过邻接法(NJ)所构建的系统聚类树图可以看出同属序列聚在一起,同种个体的聚集趋势十分显著,相同物种相应分支的支持值均为100。所研究的3个科51个个体分成3个支系。游蛇科Colubridae的31个个体构成了第一个支系,后与第二支系眼镜蛇科Elapidae聚类；第二支系眼镜蛇科由舟山眼镜蛇,银环蛇与眼镜王蛇3种蛇构建,自举检验置信度为77；第三支系为蝰科Viperinae6种蛇,自举检验置信度为98。4.结论4.1本文采用自行设计的引物扩增蛇类各物种,均得到了100%的扩增效率与测序效率。4.2COI作为DNA条形码对文中20余种常见药用蛇类具有较好的鉴别能力,并精确至物种的划分。4.3本研究为蛇类物种间亲缘关系提供了新的参考信息,利用DNA条形码技术能对物种进行分类、鉴别,为物种保护提供了重要的技术手段。二.金钱白花蛇及常见混伪品的DNA条形码鉴定1.目的本文拟收集了金钱白花蛇及其常见混伪品,扩增其COI序列,利用DNA条形码技术对金钱白花蛇及其混伪品进行鉴别研究。2.方法2.1标本采集收集和采集金钱白花蛇及其常见混伪品共9种蛇的原动物标本39份,经鉴定后,置95%酒精中,保存于标本馆；从市场上购买金钱白花蛇生药10份。2.2DNA的提取及COI序列扩增、PCR扩增产物回收纯化及测序、序列比对及分析。方法同“华南地区常见药用蛇类DNA条形码研究”所述。对所提取的DNA的COI序列进行扩增,引物采用LC01490和HC02198双引物扩增,引物序列分别为：LCO1490:5'-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G'-3,HCO2198:5'-TAAACT TCA GGG TGA CCAAAAAAT CA'-3。3.结果3.1碱基组成与变异位点银环蛇与其主要混伪品的COI序列存在较多变异位点,有255个变异位点,403个保守位点；A、T、C、G碱基平均含量分别为26.5%、29.2%、28.6%、15.8%；GC含量范围为40.1%-47.4%,平均GC含量为44.3%。各物种种内GC含量变化较小,15条银环蛇中有10条GC含量均为43.3%,2条为43.2%,2条为42.9%；4条赤链蛇中2条GC含量为46.8%,另外2条分别为46.4%和47.0%；4条铅色水蛇中2条GC含量为44.5%,另外两条分别为44.7%和44.8%；4条黄斑渔游蛇Xenochrophis flavipunctatus中2条GC含量为44.1,另两条为44.2%；其余各物种种内GC含量均相等,金环蛇B. fasciatus2条均为40.1%,尖吻蝮蛇3条均为46.0%,赤链华游蛇Sinonatrix annularis2条均为45.9%,舟山眼镜蛇3条均为47.4%,百花锦蛇E. moellendorffi2条均为42.6%。3.2种内变异银环蛇的15条种内序列,主要变异位点有14处,其转换／颠换值为6；转换总数为12,在5、214、268、298、318、500、622的位置进行T-C转换,在181、184、499、517、628的位置进行A-G转换；颠换总数为2,分别在217的位置G-C颠换,562的位置A-T颠换。银环蛇种内平均K2P距离为0.0103,种内最大K2P为0.0201,种内COI序列变异较小。赤链蛇的种内K2P距离范围为0.0030-0.0361,平均种内K2P距离为0.0195；铅色水蛇种内K2P距离范围为0.0015-0.0030,平均值为0.0023；黄斑渔游蛇的种内K2P距离为0-0.0015,平均值为0.0010；舟山眼镜蛇、尖吻蝮蛇、金环蛇、百花锦蛇和赤链华游蛇的种内K2P距离值均为0。3.3种间变异种间平均K2P距离为0.2178,最小种间平均K2P距离值出现在金环蛇与银环蛇之间为0.1557,远大于Hebert所推荐的物种鉴定最小种间遗传距离0.027；最大种间变异为0.2578,出现在金环蛇与尖吻蝮蛇之间。银环蛇与金环蛇的种间遗传距离最小,与尖吻蝮蛇的种间遗传距离最大。3.4金钱白花蛇及其混伪品的NJ树基于9种蛇的39个COI序列,通过邻接法(NJ)所构建的系统聚类树图同属序列聚在一起,且各物种又形成相对独立的枝,其支持率均为100。从基于COI序列的NJ树中明显地看到,银环蛇与其混伪品能够很好地区分开。3.5动物饮片序列比对及检索结果从广东市场上收集金钱白花蛇药材10份,获得其COI条形码,在BOLD系统中进行检索,利用BOLD系统中的鉴定引擎,能迅速准确地鉴定出金钱白花蛇的真伪,并确认其物种信息,物种相似度达到99.08%-100%。4.结论4.1基于COI序列的DNA条形码鉴别金钱白花蛇及其混伪品的方法切实可行,弥补传统形态学方法的不足,可以推广应用于实际；4.2在BOLD平台上建立了金钱白花蛇及其混伪品数据库,将金钱白花蛇生药样品的COI序列用BOLD鉴定引擎进行鉴定,可以快速明确其真伪,并确认其物种信息。   

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