一种含溶菌酶的犬猫口腔护理喷剂及其制备方法与流程

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本发明属于动物口腔保健品技术领域，特别是涉及一种含溶菌酶的犬猫口腔护理喷剂及其制备方法。

背景技术：

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宠物（犬猫）的口腔健康一直是养宠用户容易忽视的地方，约有一半的宠物或多或少存在口腔问题。引起口腔问题主要有以下三点，1、食物残留在口腔中发酵，形成腐败物，长期存在容易导致炎症的发生，如牙周炎，牙龈炎等，并伴随着口腔异味（口臭）；2、口腔异味还有可能由于舌苔造成的，舌苔是舌头表面存在的一层白色苔状物，它是由食物残渣、口腔中脱落的黏膜细胞以及细菌等构成的；3、细菌。肠道致病菌幽门螺旋杆菌也能引起口臭，医学上大量的临床数据表明，幽门螺杆菌与口臭具有一定的关系。其他细菌例如口臭产生菌和蛀牙产生菌都会引起不同程度口腔疾病。随着养宠用户对宠物健康的重视程度增加，尤其是口腔护理方面，市面上目前推出了宠物口腔护理相关产品，例如洁牙棒、洁牙粉、漱口水、口腔复合益生菌，用来针对不同情况的宠物口腔健康。但目前的产品存在见效慢、治标不治本的情况，例如口腔的致病菌无法彻底清除。
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溶菌酶是一种无毒副作用的蛋白质，氨基酸残基个数一般在100个以上，例如鸡蛋清溶菌酶含有129个氨基酸残基，按溶菌酶的来源可分为清溶菌酶、动物溶菌酶、植物溶菌酶、微生物溶菌酶和细菌噬菌体溶菌酶，溶菌酶是一种可以水解致病菌黏多糖的碱性酶，具有广谱溶菌的作用，使其广泛应用在食品防腐剂、皮肤炎症以及医学领域上，在人的口腔健康领域，溶菌酶喷雾剂能治愈各种口腔疾病，例如牙周炎、口臭等，同时也可用于口腔疾病预防和日常口腔保健，用后口气清新、无毒副作用，能够高效广谱杀菌。但目前在犬猫上的溶菌酶应用较少。
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此外，柿子提取物近年来被发现能够有效改善口气，其中柿子单宁是柿子提取物中的主要成分，其主要通过清除口臭产生菌(牙龈卟啉单胞菌，porphyromonas gingivalis)和蛀牙产生菌(变形链球菌，streptococcus mutans)来改善口腔健康，进而改善口气，具有较好地辅助改善口腔问题的效果。目前柿子单宁在宠物口腔保健上应用较少，其适口性问题得到改善将会在宠物健康领域得到广泛应用。

技术实现要素：

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为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种含溶菌酶的犬猫口腔护理喷剂及其制备方法。
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一种包含溶菌酶的犬猫口腔护理喷剂，包括以下质量份数的原料，鸡蛋清溶菌酶0.35-0.75份、柿子单宁（经结构检测，柿子单宁属于缩合单宁）0.5-1份、金银花提取物（主要成分是木犀草素和槲皮素）8-15份、苦参0.45-1份、草珊瑚10-15份、甘草10-15份、木糖醇1-3份、壳寡糖0.1-0.5份、聚合磷酸盐0.5-1份，宠物增味剂0.05-0.3份、水30-50份。其中溶菌酶不超过口腔护理组合物喷剂总质量的0.75%，柿子单宁不超过喷剂总质量的1%。
afa52017.1）。得到序列之后再利用protparam tool软件（https://web.expasy.org/protparam/）和swiss model软件（https://swissmodel.expasy.org/）对溶菌酶进行结构预测和模型建立，其结构预测为异（源）寡聚体（hetero-oligomer）结构，鸡蛋清溶菌酶的空间结构预测图如图1所示。通过分析其结构发现，溶菌酶分子空间结构是通过四个二硫键(cys 6-127、cys 30-115、cys 64-80、cys 76-94)保持结构稳定。自然状态下二硫键比较稳定，当加入还原剂时，二硫键很容易被还原，使其结构松散，表面积增大，能够更好地附着于细菌表明，而加入磷酸盐缓冲液有助于保持溶菌酶溶液的稳定性，使溶菌酶活性发挥最佳，同时通过最优化地配比实验使犬猫口腔护理喷剂发挥最佳效果。
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实施例2
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鸡蛋清溶菌酶喷剂的抗菌实验（mic）（1）将细菌（大肠杆菌、口臭产生菌、蛀牙产生菌等）接种于mh肉汤固体培养基上，培养至长出单菌落；（2）挑取单菌落接种于3ml mh肉汤培养基中，放入摇床培养至菌液浑浊；（3）取30μl 菌悬液转接至3ml新鲜mh肉汤培养基中，恒温震荡培养至od
600
=0.5左右；（4）取菌悬液10μl转接至10ml新鲜mh肉汤培养基中涡旋混匀，控制浓度在1
×
105—5
×
10
5 cfu/ml，用于mic的测定；（5）先向无菌96孔圆底板加入90μl制备好的细菌悬液，再逐一加入10μl相应浓度的不同配比的口腔护理液或溶菌酶，然后不同组的溶液进行梯度稀释，至终浓度为1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125（μg/ml）每种抗菌物质做三个重复，另外，设阳性对照孔为不加抗菌物质，只加100μl细菌悬液，阴性对照孔加100μl mh培养基；（6）将96孔板置于37℃生化培养箱中保湿静置培养18-24小时，培养完后观察各孔底部是否有细菌沉淀产生，无肉眼可见细菌沉淀的最小浓度可判定为抗菌物质的mic。
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检测结果如下：如表2所示，与对照组相比，柿子单宁具有一定的抗菌活性（≥128μg/
ml），溶菌酶也具有良好的抗菌活性（32-64μg/ml）优于柿子单宁，组合物中对比例2和对比例3的配比效果最优，对不同细菌均具有较好的抗菌效果，尤其是对革兰氏阴性菌例如牙龈卟啉单胞菌具有较强的杀菌作用（8-16μg/ml），对金黄色葡萄球菌也具有较好的杀菌效果，值得注意的是，相对于对比例3，对比例2的溶菌酶和单宁含量更低且抗菌效果与对比例3相当，说明对比例2的经济适用性优于对比例3。
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实施例3 鸡蛋清溶菌酶的酶活检测（1）将不同溶菌酶样品稀释成10-1~10-3，根据鸡蛋清溶菌酶测试盒说明书操作方法，检测不同试验组酶的活力，试验分为三组：空白孔（4 μl双蒸水+40 μl缓冲液+40 μl基质液），标准孔（4 μl酚标准应用液+40 μl缓冲液+40 μl基质液），试验孔（4 μl待测样品+40 μl缓冲液+40 μl基质液）；（2）将96孔板转移至水浴锅，37℃，水浴30min。（3）计算样品的酶活力计算公式，溶菌酶活力（u/l）=（测定od值-空白od值）/（标准od值-空白od值）
×
酚标准品浓度（0.1 mg/ml）
×
100 ml
×
样本测定前稀释倍数
×
7.14。溶菌酶活力单位定义：100 ml血清或液体在37℃与基质作用30min产生1 mg酚为1金氏单位，1金氏单位=7.14u/l。
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（4）相对酶活力的测定：测定未经处理的溶菌酶酶活力为100%，以此为参照，计算经过其他处理的相对酶活力，以研究试验组各组合物产品老化20天后的溶菌酶活度。
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不同试验组的鸡蛋清溶菌酶活性结果如图2。由图2结果可以看出，对比例2和3的溶菌酶活性在20天以后仍高于70%，说明具有较好的抗菌活性，其中对比例2的活性保持最好达到75%，磷酸盐缓冲液提供的稳定盐溶液环境有助于抑制细菌在溶液中的滋生，可以较长时间维持溶菌酶的活性，柿子单宁辅助杀菌作用也有利于溶菌酶保持酶活。
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综上结果所述，相比单一的溶菌酶或单宁，溶菌酶与单宁的组合能够更高效地杀死病原菌，从而改善口腔炎症情况。相对于其他试验组，对比例2的样品溶液（溶菌酶0.5份、柿子单宁0.75份、金银花提取物12份、苦参0.7份、草珊瑚12份、甘草12份、木糖醇2份、壳寡糖0.3份、聚合磷酸盐0.75份、宠物增味剂0.2份、水40份）表现出较好的抗菌活性，与溶菌酶和单宁含量更高的对比例3效果相当，说明对比例在保持较好抗菌活性的同时，经济适用性更强，同时在20天后仍具有较好的酶活，说明保持时间较长，持续作用效果也较长。
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上述试验结果和实施例是对本发明的具体描述，但是本发明不仅局限于上述的具体实施方式，上述试验结果仅仅是部分例子，并不是限制在这些示例当中。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变形或修改，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

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