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脑声常谈丨重新定义社交行为评估：自闭症谱系障碍啮齿动物模型的多模态方法

来源：萌宠菠菠乐园时间：2024-10-25 15:52

近年来，社交神经科学取得了重大进展，包括产生了大量自闭症谱系障碍啮齿动物模型的研究。大部分研究仍然依赖于少量简单的行为范式，在评估结果时没有全面考虑行为动力学。

基于此，以色列海法大学神经生物学系Shlomo Wagner研究团队在Molecular Autism杂志发表综述“Beyond the three-chamber test: toward a multimodal and objective assessment of social behavior in rodents”揭示了除了三箱社交测试之外：需要对啮齿类动物的社交行为进行多模式和客观的评估。

在每个范式中只评估了少数变量，因此忽略了两个同种动物之间社交互动的复杂性的重要部分。通过讨论评估啮齿动物社交行为最常用范式—三箱社交测试，进一步证明了这些约束。作者还指出，尽管情绪极大地影响了人类的社交行为，但缺乏可靠的方法来评估动物在社交任务中的情绪状态。充分的社交行为分析需要一种新的多模态方法，该方法需要在社交互动动物的高时间分辨率下自动同时测量多个行为和生理变量，这些变量可以用来评估动物模型中的社交情绪状态，从而阐明社交行为的复杂性，从而对调节这些行为的大脑机制获得更深层次的了解。

什么是三箱社交测试？

三箱社交试验是评价ASD小鼠模型中社交行为最常用的方法之一。它用于评估动物对社交环境的偏好。在这项任务中，被试小鼠被放置在一个三室装置的内侧室进行习惯化。三箱社交装置包括一个62cm×42cm×24cm三箱箱体和两个直径8cm的圆柱形罩笼、录像系统。测试当天，提前30min将实验小鼠和工具小鼠(与实验小鼠同性别，同品系，之前从未接触过)移至行为室适应环境。三箱社交实验分为适应阶段和测试阶段。在适应阶段，关闭两侧箱体隔板，将实验小鼠放入装置中间箱体中自由探索5min。测试阶段时，先将工具小鼠放入两侧箱体任意一侧罩笼中，同时打开两侧箱体隔板，实验小鼠在三个箱体自由探索，从顶部视频俯拍实验小鼠在装置内10min的活动。结束后，分析实验小鼠在三个箱体中探索时间占比。将有工具小鼠罩笼一侧定义为社交区、中间箱体定义为中间区、摆放空罩笼一侧定义为空白区，计算Preference score=(社交区探索总时长－空白区探索总时长)/(社交区探索总时长+空白区探索总时长)。采用Preference score评价小鼠的社交偏好。Preference score越接近1，说明小鼠更倾向于与工具小鼠社交，社交状况良好;当Preference score越接近-1，即与工具小鼠社交互动少，说明小鼠具有社交障碍。每只实验小鼠测试完成后使用75%酒精清洁装置和去除气味，待酒精挥发完毕后再测试下一只动物。

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被监控变量的数量有限：

通过三箱社交测试对社交行为的评估通常仅限于监测一个或两个变量，仅使用一两个变量来评估社交行为可以将其复杂性降低为一个单一的维度。未来对啮齿类动物社交行为的评估应该包含更微妙的变量，如对身体姿势的准确检测，并结合在被使用的范式中的行为动力学分析。这种方法不仅对提高行为测试的翻译效度至关重要，而且对社交行为的不同方面之间的区分也很重要。尽管三箱社交测试的方法很简单，但对于其使用的标准化方案仍然缺乏共识。方案的变化包括习惯期的差异，目前范围从5 min到10 min，甚至20个min。另一种变化包括受试动物在习惯阶段可以进入的竞技场部分；一些程序将习惯空间限制在三室设备的中央室，而另一些程序则允许动物探索整个竞技场。例如，CD1远系繁殖的小鼠，当它们只习惯于中央房间时，并没有表现出社交偏好。相反，当他们在期暴露于所有三个房间时，表现出完整的社交偏好。

需要进行多次测试：

即使使用三箱社交测试（或任何其他社交任务）检测到社交缺陷，仅凭一项测试也不能作为得出某种小鼠模型是否存在社交受损的结论。一个例子是Iqsec2 A350V系，它在三箱社交测试中表现出完整的社交偏好和社交新奇偏好，但在性别和情绪状态偏好上也表现出缺陷。需要采用多种行为分析来进行NDD动物模型的表型和探索。例如，ASD是一种异质性疾病，在自闭症个体的共病和多种相关症状，如癫痫发作、焦虑、智力迟钝、对感觉刺激的高反应性或低反应性，以及运动异常。例如，ASD小鼠模型可能表现出异常的社交方式和社交认知，这是由于先天的高焦虑水平、感觉感知受损或运动缺陷，而不一定是由于社交动机的改变。

混杂变量：

被试者的社交行为可能会受到其他混杂变量的影响，这些变量可能会影响或掩盖任何社交任务的结果。这些因素包括社交等级和攻击性，应变，实验设置，如照明条件和使用一个新的测试领域等。两个最常见的测试评估焦虑水平和焦虑相关行为是高架十字迷宫（EPM）和旷场测试(OFT)，两者都依赖于啮齿动物的先天矛盾驱动探索一个新的空间和开放空间之间的恐惧。EPM由一个正形迷宫组成，其中有两个张开的手臂和两个闭合的手臂，由一个高于地面的中央平台相互连接。焦虑是通过计算受试动物在张开手臂上的时间百分比来测量的，在张开手臂上的时间越多，表明焦虑水平越高。在OFT测试中，被试动物被放置在一个有墙壁的盒形竞技场中，并在实验过程中跟踪动物的运动轨迹。然后，通过计算沿着竞技场墙壁所花费的时间与中心所花费的时间的百分比来评估焦虑，沿着墙壁所花费的时间越多，表明焦虑程度越高。这些测试的表现也有多种混杂变量，包括物种、应变、性别、年龄、之前的处理和压力暴露、光照水平和之前的测试经验。研究发现，仅仅依赖一种测试，如EPM或OFT测试，并不能确定大鼠的焦虑水平，这再次强调了通过应用多重测试来消除验证焦虑的必要性。

目前在ASD模型中用于表现型社交缺陷的行为范式往往忽略了任何形式的社交行为的一个关键组成部分，即相关受试者的情绪状态。最近越来越多的证据表明，啮齿类动物具有比曾经认为的更高的情绪认知水平，它们的情绪状态可以通过产生认知偏见和诱导对相同刺激的双重缺陷来影响它们的行为。评估动物模型中的情绪状态仍然依赖于相当有限的工具。

啮齿类动物的社交情绪状态

虽然没有共识的情绪防御，但这些可以被视为由特定神经回路处理的内在或外在刺激触发的中枢状态，并驱动行为、认知、躯体和生理反应。这种情绪的防御并不需要主观意识的存在作为体验情绪的要求。因此，最基本的和更原始的情感形式状态可以在动物的中找到。啮齿动物的情绪状态可以被认为是对环境事件的复杂和灵活的反应，可以持续一段时间，并影响随后的行为决策。例如，大鼠的情绪状态被发现会了它们的决策行为，就像在模糊线索解释测试中看到的那样，在该测试中，动物首先被训练将一个线索与奖励结果联系起来，第二个线索与避免惩罚或奖励较少的结果联系起来。小鼠和大鼠都使用多种方式交流情感内容，这些表情包括一些姿势，如僵直，嗅探，抓挠，不同频率的发声，气味标记和信息素线索的释放，以及情感状态，以及对情绪显著事件的不同面部表情等。大鼠暴露于压力和恐惧条件下的笼子同伴中，增加了笼子同伴的异体修饰，促进了在恐惧条件反射范式的训练阶段获得回避行为，并增加了恐惧记忆保留。现有的研究结果表明，小鼠具有识别和对其他同种动物的痛苦作出反应的能力。例如，暴露于疼痛的笼子伴侣增加了同样经历疼痛的观察小鼠的疼痛行为，并诱导了对伤害性刺激的超机械和-热敏感性。此外，暴露于电击的笼子伴侣的小鼠表现出更多的社交倾向和同种异体梳理，表明情绪反应。

图一小鼠的社交交流方式

发声

啮齿类动物发出的发声可作为一种交流工具，其频率范围根据情绪背景的不同而变化。由于幼犬的叫声发射受到母性线索的调节，并受到抗焦虑/致焦虑药物的影响，因此幼犬的超声发声（USV）分析可以被认为是研究啮齿动物情绪发展的合适模型。这些动物在负面情绪环境中以22 kHz的频率发射USV，如暴露于捕食性动物、威胁、疼痛，以及在停用药物期间，如苯二氮卓类药物和精神兴奋剂。相比之下，50 kHz USV在更活跃的环境中被释放，包括游戏引诱、性互动、社交探索和药物诱导的奖励状态。22和50 kHz USV都受到社交经验的影响，长期的社交隔离减少了22 kHz叫声，在游戏互动中增加了50 kHz叫声，表明社交动机的增加。研究还发现，小鼠会发出各种频率广泛的声音，可以分为非USV，包括低频（LFHs）和中频发声（MFVs），以及超声USV。LFHs，或“吱吱声”，是由和声组成的具有人类可听到的功率和频率低于5 kHz。这种声音主要是在令人厌恶的环境中发出的，比如疼痛、躁动和呕吐。MFVs包括频率范围在9到15 kHz之间的发声。小鼠USV表现出许多结构和时间上复杂的声学特征，这些特征在发育阶段、遗传系、性别和社交背景中不同。虽然小鼠的USV是先天的，但它高度受社交经验的影响。例如，雄性USV对雌性的声学特征和音节变量受雌性的发情状态、雌性的尿液等。后来的研究发现，雌性小鼠在与雄性互动时确实会发声。人们对超声波发声的研究目前受到技术挑战的阻碍，包括在与两种或更多的动物互动时确定发声者的身份。有研究使用四通道超声波话筒无线系统结合声源定位方法，通过使用四个麦克风，提取给定声音信号的多个估计，然后以确定源的位置。

图二在成年大鼠和小鼠中的超声发声的社交背景

图三识别一个发声主体的实验设置

尿的气味-标记

啮齿动物在许多社交环境中，同种动物使用尿液气味标记（以及其他方式）与同种动物交流，包括个体识别生殖状态评估。通过尿气味的交流主要是由两类蛋白质介导的，特别是主要组织相容性复合体（MHC）和主要尿蛋白（MUPs）。在发育过程中，尿液的气味标记发生变化，C57BL/6J小鼠暴露于新的CD1刺激或仅在2-3个月时出现雌性刺激后排尿增加。在雄性间的互动中，尿标记被用于领土建立，并被支配和被社交失败所抑制。它还提供了雄性间的攻击和攻击行为的表现。尿标记也传递了对特定同种小鼠的社交记忆和习惯化，因为反复暴露于同一同种小鼠与C57BL/6J雄性小鼠尿液气味标记的减少相关，并在引入新的刺激后恢复。在BTBR 和Cntnap2−−中发现了雄性受试者对发情雌性尿液的反应，但在16p11.2df+小鼠中没有，这表明尿气味标记在一些ASD模型中被破坏。闪烁标记是一种信号的主动发射，该信号在同种动物之间具有社交功能，能够传递和诱导各种环境下社交缺陷行为的变化，因此值得进一步研究。

嗅探

嗅探是一种主动的呼吸行为，是获取和采样气味的必要条件，通常表现出的频率高于平均呼吸频率，表现在动机行为中，如社交行为。高攻击性的大鼠在探索新的环境时表现出嗅探的减少，并伴随着焦虑相关行为的增加，这表明嗅探可以作为测量动物唤醒状态的生理标记。此外，嗅探和其他口面部行为，如摆动和头部位置的变化，在theta频率（4-12Hz）显示振荡模式，这一频率反映了觉醒，与大脑区域之间的信息交换有关。嗅探的异常也与社交和性驱动的降低相关。

面部表情

在人类中，面部表情是传递他人的主观情感体验和他人情感体验推断的丰富信息来源。然而，在啮齿动物中，面部表情作为物种间交流方式的重要性可能不如人类明显，因为啮齿动物的面部肌肉发育较弱，面部表情变化相对较差。尽管如此，最近的证据表明，啮齿类动物的面部表情传达了有关个体情绪状态的信息。例如，小鼠的面部表情表现出明显的变化，包括鼻子和脸颊的隆起，以及耳朵和胡须对有害刺激的变化一种用于评估小鼠中疼痛反应的小鼠面部表情量表。在居住者-入侵者测试中，小鼠对入侵者反应出出眼睛紧闭、耳朵扁平，但对猫的气味却没有反应。虽然面部表情的交流价值及其在指导啮齿动物观察者行为方面的重要性尚不清楚，但对面部表情的分析仍然可以提供对动物所经历的情感状态的独特见解，因此可以用于评估对某些刺激/治疗的情感反应，以及这些反应在病理条件下如何改变。

行为的刺激

自然界中的社交互动很少是单方面的，而且往往需要行为的瞬时变化和多个参与者之间的相互反馈。然而，用于估计社交行为的行为任务通常限制了社交互动的物理范围，并关注个体主体的行为，忽略了社交互动的二元性质和刺激对驱动主体行为的贡献。大鼠在听到一定频率的USV时进行的模糊线索解释测试中也表现出认知偏差。暴露于50 kHz USV的大鼠对模糊音调的判断表现出乐观偏差，而暴露于22 kHz发声的大鼠表现出悲观偏差，表明USV能够注入听者的情绪状态。在回放中听中频呼叫时，小鼠也表现出较高的皮质酮水平和焦虑相关行为，进一步限制了刺激发出的发声可以改变受试者的有效状态。这些结果表明，刺激发出的多种感官线索的整合对于刺激的表征和驱动被试的社交行为是重要的。总的来说，在分析任何社交互动时，刺激物的行为和有效状态的贡献也应该包括在内。

图四一种用于社交行为分析的多模态方法

总结

在任何给定疾病的小鼠模型中建立社会缺陷的存在需要依赖于多个行为范式或变量，因为这种方法是二元的，并且容易受到各种混杂变量的影响，这可能会损害任何发现的结论性。因此，在动物模型中对行为缺陷进行表型分析应该系统地使用一系列行为任务来解决社交行为的不同方面和背景。此外，结合各种方法，在任务过程中对多种生理和行为变量进行详细和自动分析，并将这些变量与大脑记录和机器学习算法相结合，将在遇到各种社会刺激的动物受试者的社会互动过程中确定和描述社会情绪状态。这种分析啮齿类动物社会行为的综合方法不仅将加速对所涉及的大脑机制的研究，而且还将使人类患者和病理状态的动物模型之间的缺陷进行真正的比较。

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