动物行为与电生理专题丨光遗传学在小鼠恐惧排尿范式的应用

小鼠的性格胆小，是建立恐惧排尿模型的理想模式生物。TMT是一种被广泛用于研宄气味诱导的先天性恐惧的化合物，是从狐狸尿液中提取的物质。小鼠只要一闻到这股气味，就会吓得僵住，一动不动。

TMT诱发恐惧排尿行为（旷场）

行为装置为40ｘ40cm的旷场，在旷场的一个角落通过双面胶固定一个3cm的带盖子的培养皿，培养皿中放有滴加了TMT或生理盐水的棉球，在测试阶段将小鼠放入旷场中并去除培养皿的盖子，小鼠在旷场中自由活动10分钟后拿出，同时将培养皿的盖子盖上。每只小鼠实验完毕，利用75％的酒精檫拭行为装置两次，然后用干纸巾将残余酒精擦干，待酒精完全挥发后，放入下一只动物进行行为测试。行为房间全程保持通风，以免环境中TMT含量过高。行为测试期间保持全程录像。观察到当小鼠主动嗅闻TMT后，便会逃跑至与TMT放置地方相对的一侧排尿，实验组的排尿比率为60％，远高于对照组。由此可以看出TMT能够引发小鼠的恐惧排尿行为。

TMT诱导的小鼠恐惧排尿行为

（A）在旷场环境通过TMT诱导小鼠恐惧排尿试验示意图。（B）代表性图片展示TMT能够诱导小鼠出现排尿行为。（C）暴露于TMT或生理盐水对照的刺激下，小鼠出现排尿现象的比率

利用能够引发小鼠本能恐惧行为的狐狸气味TMT刺激矿场中的小鼠，观察到TMT确实可以引发小鼠的恐惧排尿行为，但是其恐惧表型不明显，无法进行量化。这可能是由于在实验过程中TMT始终暴露于旷场的一角导致整个旷场充满了天敌的气味，从而使得在旷场中自由活动的小鼠对这种危险环境的敏感度降低。现代医学研宄发现，突然的惊吓，是对精神的一种极其强烈的刺激，因此，可以通过精确控制进气量和进气时间点，给予处于安全环境中的小鼠突然地TMT刺激以建立稳定的气味介导的恐惧排尿模型。此外，2MT（2-甲基-2-噻唑啉）是一种强效的狐狸尿液TMT的类似物，可以诱发小鼠更强烈的恐惧行为所以在恐惧排尿造模中可以用2MT代替TMT。

Bar的谷氨酸能神经元参与恐惧排尿行为：将150nL的rAAV9-CaMKIIa-Dio-eGFP注射于FosTRAP2小鼠的的单侧Bar区域，坐标为：前囟向后5.55mm，旁开0.67mm，深度3.76mm，共注射12只小鼠，病毒注射一周后开始行为实验。

注意事项

所有的行为实验均需提前2天进行抚摸小鼠5分钟，使其能够适应实验过程中实验人员的抓握以及光纤的插拔。在行为训练或测试中，每只小鼠实验完毕，利用75％的酒精擦拭行为装置两次，然后用干纸巾将残余酒精擦干，待酒精完全挥发后，放入下一只动物进行行为测试或训练，以消除前一只动物残留气味对后一只动物行为的影响，行为箱下方铺一层滤纸，以观察排尿现象，每换一只小鼠换一层滤纸。在光遗传刺激实验中，小鼠头上植入的光纤－陶瓷插芯与直径为200mm的光纤跳线相连，光纤跳线通过光纤旋转耦合器与蓝光激光器相连，光纤旋转耦合器可以消除小鼠运动产生的旋转扭力，从而避免光纤打结影响小鼠运动。使用的光遗传学激活神经元和通路的功能元件为ChR2，诱导其发挥功能的激光参数为：波长473nm、光刺激强度3-8mW，脉宽5ms、频率20Hz；光遗传抑制的功能元件为GtACR1，诱导其发挥功能的激光参数为：波长473nm、光刺激强度3-8mW，直流激光持续刺激。上述参数均由波形发生器控制。

恐惧排尿模型

行为系统包括Master8控制器、声音系统、电击系统、信号灯系统、行为箱主体、录像系统。声音系统包括声音控制器、小音箱；电击系统包括电极板、电刺激器；由Master8触发声音系统和电击系统。行为箱为长、宽、高15ｘｌ5ｘ50cm的长方体，箱体侧壁皆为白色，箱体左右两侧壁底部有1cm的镂空可插入电极板，箱体被装有透明玻璃板的支架支撑，箱体上方与玻璃板正下方各安装一个数码摄像机。适应阶段，提前1天将小鼠放入底部为电击板或透明玻璃板的行为箱自由活动各10分钟，电击板或透明玻璃板适应时间间隔2小时，模糊化小鼠对电击板和透明玻璃板的记忆；经过适应的小鼠被随机分为实验组和对照组。造模阶段，小鼠放入底部为电击板的行为箱自由活动1分钟后，给20秒的声音刺激（9000Hz）伴随信号灯亮指示，实验组在声音刺激的后2秒给予不同强度的足部电击（0.4mA、0.8mA、1.2mA、1.8mA），对照组不给予电击，声音－信号灯－电击＼声音－信号灯共配对3次，每次间隔3分钟，每天重复训练两次，连续造模2天。测试阶段，将电击板切换为透明玻璃板，小鼠自由活动1分钟后，给20秒的声音刺激伴随信号灯亮指示，声音－信号灯共配对3次，每次间隔3分钟。行为全程由上下两个方位的数码摄像机录像。

光遗传学激活实验：先将小鼠放入行为箱中适应1分钟后，给予20秒的蓝色激光，激光共刺激3次，每次间隔3分钟。刺激结束1.25小时后对小鼠进行心脏灌流。

恐惧排尿行为范式的建立

TMT被广泛的用于研宄小鼠的气味诱导的先天性恐惧。虽然它也可以引发处于旷场中小鼠的恐惧排尿行为，但小鼠的恐惧表型不明显，使得无法进行量化。为了建立稳定的恐惧排尿模型，1）第1天，将小鼠放入电击板上适应10分钟，切换电击板成透明玻璃板，间隔2个小时，然后将小鼠放入玻璃板上适应10分钟，使小鼠模糊对电击板和透明玻璃板的记忆；2）第2天，经过适应的小鼠被随机分成实验组和对照组，设定时长为20秒的单一频率声音信号，实验组给予3次（两次声音间隔3分钟）以声音信号为提示的不可逃避后2秒足底电击，对照组仅给予3次声音信号，重复训练2次；3）第3天，重复第2天步骤；4）第4天，将电击板换成透明玻璃板，只给予20秒的声音提示信号来测试小鼠的恐惧排尿反应。为了确定恐惧排尿模型的最佳实验参数，设置不同强度的电击刺激：随着电流强度的逐渐增加，小鼠冻结的比例升高，排尿的比率近似线性增长且在1.2mA后达到平台期，而排尿的潜伏期倒数呈线性增长。这表明1.2mA为恐惧排尿模型的最适电击强度，该条件下排尿比率为42.9％，冻结的比例为53.2％。

恐惧排尿行为学范式的建立

（A）恐惧排尿模型建立示意图。（B-C）随着足部电击电流强度的逐渐增大，小鼠冻结行为的比例（B）显著增加、排尿的比率增加而且潜伏期（C）逐渐缩短。（D）在20秒声音提示期间，对照组、恐惧组和恐惧排尿组小鼠的平均活动量以及恐惧排尿组小鼠的平均排尿潜伏期。（E）代表性对照组、恐惧组和恐惧排尿组小鼠在20秒声音提示期间的活动量。（F）恐惧排尿组小鼠冻结行为的比例在20秒声音提示期间相对于对照组和恐惧组小鼠显著增加，而且恐惧组小鼠的冻结比例相对于对照组小鼠也显著增加。

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