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脑声问答（27）期丨纹状体损伤动物模型建立与行为评估方法

来源：萌宠菠菠乐园时间：2024-11-07 17:37

PD患者脑内以及PD模型动物纹状体中均存在GDNF含量降低。纹状体损伤成为PD运动症状不断进展的一个风险因素。

分组与造模

将25只SD大鼠按随机数字表法随机分为假手术组（n=6）和手术组（n=19），所有大鼠术前禁食12h，称体质量后，用10%水合氯醛3mL/kg经腹腔注射麻醉。麻醉后，手术组采用Longa法制备左侧大脑中动脉栓塞（MCAO）模型，仰卧固定大鼠，颈部皮肤消毒备皮后，沿前正中线切开颈部皮肤，以此分离左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉；用结扎线依次结扎颈动脉近心端，用显微血管夹夹住颈内动脉，在距颈总动脉分叉处约1.0cm处用显微剪刀剪一切口，将直径为0.2mm的鱼线从切口处缓慢进入颈内动脉，松开血管夹，当鱼线头端到达大脑中动脉起始端处（从颈外动脉与颈内动脉分叉处起计算插入约18～22mm）即可。固定线栓，缝合切口。手术结束后，动物置于室温环境下苏醒。2h后缓慢退出鱼线至分叉处，从而形成缺血再灌注模型。假手术只分离左侧颈总、颈内、颈外动脉，不予插线栓。实验全过程和动物苏醒期间注意保暖，保持室温在25℃左右，直至大鼠重新恢复活动。手术后，大鼠予正常进食及饮水。大鼠苏醒后，根据Longa评分法对其进行神经功能缺损评分，用以判断模型是否成功：无神经功能缺损，0分；提尾时右前肢内收，不能完全伸展，1分；自发行走时向右侧转圈，2分；行走时身体向右侧倾倒，3分；不能自发行走，有意识丧失，4分。0分及4分者给予剔除。最终18只大鼠纳入研究，假手术组、模型组、电针组各6只。

行为学检测

1旷场试验

旷场试验是PD模型动物常用的一种行为学评估方式，其运动距离、运动速度等可以评估模型动物的运动能力，而实验动物在反应箱内状态及经过区域则可以用来评估焦虑抑郁状态，能够在一定程度上反应PD的非运动症状。旷场实验设施主要包括一个反应箱，一个关联相机及一台软件分析电脑。反应箱一般是长1m×宽1m×高0.5m，由于SD大鼠为白色背毛，故底板选用反差较大的黑色底板，在电脑软件中将黑色箱底均分为25个大小相同的正方形格子，外围16个方格被认为是外周区，中央9格被划为中央区域。反应箱上方的摄像头与主机相连，可自主设置相关所需实验参数，软件自动记录每只大鼠相关数据并进行分析，输出数据。

具体操作：各组完成实验要求结束后，进行行为学评分及模型检测，确定为成功模型后或干预结束后的第2天进行实验。选择在晚18点开始实验，全封闭无窗环境下进行检测，保证环境光线较暗，模拟入夜保证大鼠兴奋性。要求反应箱上无反光点，利于软件对大鼠轨迹进行捕捉。开始实验时将大鼠放入中央区域9个方格中，点击开始实验，软件开始记录大鼠运动。每一只实验大鼠测试结束及时对反应箱内进行清扫消毒，收集粪便并进行粪便粒数记录。每只实验动物检测时间为5min，系统软件自动统计大鼠的自主运动的总路程、自主运动平均速度、自主运动总时间、中央区域活动时间，人工统计大鼠垂直运动次数（当大鼠两前肢离开地面计为1次），反应箱内排便粒数（即为大鼠排便次数）。

2转棒实验

实验前将小鼠饲养于检测室，提前适应环境。实验开始时，将小鼠放于直径为30mm转棒上，先以10r/min的初始速度旋转，使得小鼠在各自轨道上保存运动平衡，逐渐将速度加速为30r/min，记录每只小鼠在转棒上停留直至掉落的时长。

3悬挂实验

悬挂实验是利用大鼠身体自重检验实验动物的四肢运动能力，及运动协调性的一种行为学检测方式。自制悬挂实验检测仪，取两段约30cm的铁杆固定于铁座中，立于左右两侧，作为悬挂装置的左右支架。在支架下方垫3-5cm厚垫料，以防大鼠掉落摔伤。取一个长约20cm，直径为1.5mm的光滑不锈钢棒，固定于两支架之间，支架两头用铁丝缠紧，保证不锈钢棒不会轻易转动或左右移动。

具体操作：各组完成实验要求结束后的第2天进行实验。测试环境保证安静，将模型大鼠双前肢挂在不锈钢棒上，使其抓住横杆，开始计时，记录大鼠在不锈钢棒上悬挂时间。开始下一只实验大鼠进行检测前对不锈钢棒消毒。

评分标准：大鼠双前肢均挂置于不锈钢棒上超过10s不掉落，记3分。双前肢仅1只挂置于不锈钢棒上超过10s不掉落，记2分。在不锈钢棒上保持时间大于1s，小于10s掉落，记1分。在不锈钢棒上保持不到1秒即掉落，记0分。

4爬杆实验

爬杆实验是评估实验动物运动的协调能力的一种范式行为学检测方式。备一根长度1m，直径1.5cm木棒作为大鼠爬杆，固定于一铁座上，并使用医用胶布缠绕爬杆，以防止大鼠爬杆过程中滑落，在铁棒下方垫3-5cm厚垫料，以防实验大鼠摔伤。于爬杆顶端固定一直径5cm塑料球以供实验开始前大鼠站立，开始时将大鼠置于顶端塑料球上，实验大鼠在圆球上站稳时开始计时，当大鼠四肢均接触到底面平台时计时结束，表示大鼠爬杆动作完成。每只大鼠的爬杆实验结果取3次爬杆记录时间，计算均数。若大鼠未完整从顶端顺着木棒爬至底部，中途掉落、主动跳落或返回顶部，则认为该次爬杆记录无效。大鼠爬杆总时间越短，证明运动功能协调能力越高，运动障碍越小。

5前肢功能检测

前肢功能检测可以很好的检测PD患者的步态异常，可以反应干预方式能否改善PD运动能力。采用Chang等试验方法，各组实验大鼠于治疗的第1、6、11、16、21天，每次开始实验前后进行前肢功能检测。操作者将大鼠躯体后半部及后肢抬起，并同时抬起一前肢，以大鼠正手方向斜向一侧在5s内将大鼠匀速移动90cm，另一操作者观察并记录移动时大鼠着地的侧前肢在桌面上行进步数。两侧前肢交替着地，测量5次，取其均数。

6AIM评分

AIM评分是反应LID大鼠行为学异常的重要评价指标。LID模型大鼠主要有4种表现，均表现在脑立体定位注射6-OHDA区域对侧：①肢体不自主异常运动，实验大鼠前肢不自主频繁拍打身体。②轴性不自主异常运动，大鼠头颈部与躯体呈轴状扭转。③口颌不自主异常运动，实验大鼠不自主伸舌，歪舌。④运动不自主异常运动，不停旋转，首尾相接。

评分标准：每一类亚型症状分别进行评分，4个亚类评分相加为总AIM评分。每一类型AIM根据严重程度划为0~4分，0分:表示未出现AIM；1分：AIM出现持续时间小于观察时间一半；2分：AIM出现持续时间大于观察时间的一半；3分：AIM持续存在，但威胁刺激后停止；4分：AIM持续存在，威胁刺激后不停止。

腹腔注射相应药物后观察实验大鼠3h，进行评分结果统计。根据以上标准，于治疗的第1、6、11、16、21天上午用药前后接受异常不自主运动评分。

7APO旋转实验及行为学评分

28天后在与造模前同一环境下进行APO旋转实验，环境保持安静，在大鼠颈背部皮下注射APO（0.5mg/kg），放入单独笼中，10分钟后开始计数大鼠30min内向左侧旋转圈数。计算大鼠平均每分钟向左侧旋转圈数，30min内大于210圈即判定为成功PD大鼠模型。

实验开始前大鼠精神状态好，反应灵敏，毛色洁白顺滑。6-OHDA脑立体定位注射28天造模结束后，大鼠呈弓背状态，背毛变脏变黄，背毛杂乱呈扇形，自洁能力降低，拒捕行为减弱。

APO旋转中大鼠向健侧（左侧）旋转，计数30min内旋转数＞210r为成功PD大鼠模型。行为学评分标准，保留行为学评分2-8分大鼠。将符合PD模型外观形态学、行为学评分2-8分及APO旋转每分钟旋转数>7r/min的大鼠纳入后续实验。