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第六章 卵子和胚胎的冷冻保存技术;一、卵子和胚胎冷冻保存的意义;1. 建立优良品种的胚胎库或基因库，保存动物品种、品系和稀有突变体； 2. 运输胚胎代替活畜的运输，节省运输费用和检疫费用，减少疾病传播； 3. 控制品种内的遗传稳定性和维持某些近交系动物的遗传一致性，节省大量时间和资金；;1952年，Smith报道用甘油作保护剂，对兔的受精卵进行慢速冷冻。但当时无法判定该技术是否成熟。 1972年，Whittingham等首次实现了小鼠胚胎的超低温冷冻保存，冻胚解冻后移植，产出正常后代。这种方法已广泛应用于牛、绵羊、山羊、马、家兔、猪等其它哺乳动物的胚胎超低温保存。;1985年， Rall和Fahy率先将玻璃化冷冻技术应用于鼠胚胎的冷冻保存。 所谓玻璃化是指利用物理学原理，将高浓度的冷冻保护剂急速降温后，使其由液态转化为外形似玻璃状的稳定且透明的非晶体化固态，但并没有??变其在液态时的分子和离子分布。玻璃化可避免在细胞内形成冰晶而对细胞产生伤害。;冷冻和解冻处理尽管对胚胎有一定的损伤，但将解冻胚胎在体外培养一段时间后可恢复正常的形态。目前，牛冷冻胚胎移植后的妊娠率与鲜胚移植的妊娠率相似。 卵母细胞体积大，不易充分脱水，故冷冻不易成功。 ;Whittingham（1977）首次成功地冷冻保存小鼠卵母细胞以来，人们在此方面进行了大量的研究。玻璃化法冷冻的小鼠成熟卵母细胞体外受精及胚胎移植后产仔率已达20%～38%。;目前已有关于人、小鼠、牛等卵母细胞冷冻成功的报道，但其成功率较低。 于永存等（2002）报道，用玻璃化法冷冻保存牛GV期卵母细胞，解冻后其体外成熟率、体外受精率和卵裂率分别为21.6%、15.1%和11.1%，显著高于程序冷冻法和超快速冷冻法的效果。;三、卵子和胚胎冷冻保存的原理;一般卵子或胚胎在冷冻过程中不可避免要形成细胞内冰晶，但只要不形成大冰晶，而是维持微晶（冰核）状态，细胞将不受伤害。 胚胎在冷冻过程中，大约在-10℃以上细胞内不结冰，而在-10℃以下时，过冷胞质就形成冰晶。;冷冻可引起卵母细胞ZP收缩，破坏细胞骨架，损伤细胞膜和细胞内部结构的完整性，还能损伤细胞整体，阻碍极体产生，增加DNA不稳定性而导致染色体异常。 为避免此类现象的发生，一般于-7℃时采用植冰法及时启动脱水过程，从而在较高的温度下诱导形成结晶，逐渐扩散至整个溶液，避免冰晶突然形成。 ;胚胎和卵子在冷冻和解冻过程中两次通过冰晶形成危险区（-15℃～-50℃），采取适当冷冻方法和低温保护剂，使其安全通过危险温区。 进行冷冻处理前，向保存液中加入保护剂（如甘油），改变细胞膜渗透性和溶液渗透压，防止溶液效应和渗透压差异，减少降温和复温过程冰晶的形成。;常规冷冻保存胚胎是在胚胎脱水前诱导结晶，然后缓慢降温脱水，解冻时快速复温到常温。 玻璃化法使用的玻璃化液是一种粘稠的玻璃态物质，低温时不结晶就可固化。胚胎在此溶液中脱水到一定程度，可引起内源性大分子和已渗入的保护剂浓缩，从而使细胞在急剧降温过程中得以保护。;四、卵子和胚胎的冷冻保存的方法;四、卵子和胚胎的冷冻保存的方法;（1）小分子物质 单糖（如葡萄糖），双糖（如蔗糖、海藻糖），三糖（如棉子糖）和其它糖类。 （2）高分子物质 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、白蛋白、左旋糖苷、聚乙烯醇（PVA）、羟乙基淀粉和蛋黄等。 主要通过改变渗透压，引起细胞脱水，从而发挥非特异性保护作用，又称为细胞外冷冻保护剂。;不论是细胞渗透性还是细胞非渗透性的保护剂都主要是为了给细胞造成脱水状态，但脱水的同时不能影响到细胞的生存；减少细胞外大冰晶的形成对细胞造成的损害也是冷冻应注意的方面之一。 业已证实，单纯就低温保存而言，影响细胞冷冻保存的关键因素，是细胞冷冻和复温过程中，必须两次经过冰晶形成和重结晶的中间损伤温度区。在冷冻过程中，如果含水量过多，细胞可能毁于过度冰晶形成。但脱水过度，细胞也可能死亡。;理想的冷冻方案是：①找到细胞含水过多和脱水过度之间的平衡点；②合适剂量的冷冻保护剂，既可以取代细胞质膜周围的水分子，又避免“溶质效应”；③合适的冷冻速率。 ;单一保护剂很难达到胚胎或卵子的冷冻要求。在常规冷冻方法中，一般选择一种保护剂（如甘油或乙二醇）。 在快速冷冻和玻璃化冷冻中常采用多种保护剂组成的混合保护剂，如甘油和乙二醇、甘油和丙二醇、丙二醇和乙二醇、乙二醇和二甲基亚砜等，再辅以糖类。;低温保护剂的选择一般要考虑保护效果、胚胎毒性和脱除是否容易，要求所用冷冻保护剂的效果好，毒性低且解冻后易于脱除。;Scholander等（1957）报道，北极鱼可以在-18℃的水中生存，它的血清的凝固点大约比这一温度高1℃，从这种动物体内分离一种抗冻蛋白（AFP）。目前，在植物、昆虫、细菌和真菌都发现并分离出AFP。;AFP是一种

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