首页分享一种“肠

一种“肠

来源：萌宠菠菠乐园时间：2024-12-03 22:12

说明书全文

一种“肠‑脑轴”帕金森病小鼠模型的构建方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药技术领域，涉及一种动物模型的构建方法，尤其是一种“肠‑脑轴”帕金森病小鼠模型的构建方法和应用。

背景技术

[0002] 模型小鼠是研究疾病发病机制、治疗策略必不可少的工具，目前建立模型小鼠的常用方法是CRISPR‑Cas9技术。

[0003] α‑突触核蛋白(α‑Synuclein，α‑Syn，SNCA)是帕金森病(PD)中重要的病理蛋白，路易小体的主要成分是异常聚集的α‑突触核蛋白。虽然路易小体集中在大脑黒质和纹状体区域，但是对于其准确的起源位置尚无定论，目前具有挑战性的科学假说为“PD起源于胃肠道”。帕金森病目前采用的研究模型是“肠‑脑轴”模型，但是，前期“肠‑脑轴”模型有一定的弊端，均采用了PD的转基因老鼠，并注射了致病蛋白的原纤维引起肠道炎症来进行造模，所造模型本底α‑突触核蛋白及Tau蛋白的表达量较高，不能体现自然状态下致病蛋白聚集与播散的过程，且影响因素过多，无法区分致病蛋白来源。

发明内容

[0004] 为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种“肠‑脑轴”帕金森病小鼠模型的构建方法和应用，解决现有的“肠‑脑轴”帕金森病小鼠模型无法体现自然状态下致病蛋白聚集与播散的过程，且影响因素过多，无法区分致病蛋白来源的问题。

[0005] 为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

[0006] 本发明公开了一种“肠‑脑轴”帕金森病小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：

[0007] 1)将Cas9蛋白和gRNA，以及含有SNCA基因、CFOS、Sox10MCS4和Tet‑on系统的donor载体注射于供体小鼠的受精卵中，并将受精卵移植到受体小鼠中备孕，繁殖子代；

[0008] 2)让基因组中带有外源性SNCA基因的子代小鼠与野生型小鼠交配，交配得到的子代小鼠为founder小鼠；

[0009] 3)对founder小鼠采用四环素灌胃，直到小鼠出现帕金森样病理改变，认为得到“肠‑脑轴”帕金森病小鼠模型。

[0010] 优选地，步骤1)中，donor载体由SNCA、RFP、rtTA3G、CFOS、Sox10MCS4连接在pTRE3G载体上得到。

[0011] 进一步优选地，步骤1)中，将SNCA、P2A和RFP连接到pTRE3G载体上，得到pTRE3G‑SNCA‑P2A‑RFP；将rtTA3G、CFOS和Sox10MCS4连接，得到Sox10MCS4‑CFOS‑rtTA3G；再将Sox10MCS4‑CFOS‑rtTA3G连接到pTRE3G‑SNCA‑P2A‑RFP上，得到donor载体。

[0012] 优选地，步骤1)中，gRNA的序列如SEQ ID NO.15所示。

[0013] 优选地，步骤1)中，Cas9蛋白、donor载体和gRNA的体积比为1:8:2。

[0014] 优选地，步骤1)中，供体小鼠和受体小鼠均为C57BL/6JGpt雌鼠。

[0015] 优选地，步骤3)中，四环素为10mg/mL的盐酸四环素。

[0016] 优选地，founder小鼠为2月龄。

[0017] 优选地，步骤3)中，对founder小鼠采用四环素灌胃，直到小鼠出现帕金森样病理改变并逐渐加重，认为得到“肠‑脑轴”帕金森病小鼠模型。

[0018] 优选地，所述“肠‑脑轴”帕金森病小鼠模型能够出现肠道功能障碍、运动功能障碍，认知障碍和肠道及脑内病理蛋白沉积的症状。

[0019] 本发明还公开了上述一种“肠‑脑轴”帕金森病小鼠模型的构建方法得到的小鼠模型在探索肠道源性帕金森病的发病机制及神经环路中的应用。

[0020] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0021] 本发明提供的一种“肠‑脑轴”帕金森病小鼠模型的构建方法，以donor载体作为目的基因载体，在donor载体上连接的目的基因片段中含有PD的病理蛋白SNCA、CFOS启动子、Sox10MCS4增强子以及四环素诱导表达系统，采用CRISPR/Cas9技术将含四环素诱导表达系统的目的基因片段插入小鼠的Rosa26位点，通过四环素开启系统的表达，使得到的SNCA小鼠可出现多个帕金森相关脑区的多巴胺神经元病变、运动功能障碍、帕金森病晚期的认知功能障碍等典型行为学改变，从而更好地模拟帕金森病的发病过程和行为改变。在该方法中，以CFOS启动子联合Sox10MCS4增强子，能够保证donor载体上的目的基因片段的表达局限在肠道神经系统中。以“Tet‑on”系统作为突破点，在含有四环素诱导表达系统的所转基因片段中，rtTA3G在特异启动子驱动下表达，使其构象不能结合到pTRE3G启动子上；当给予基因小鼠四环素后rtTA3G的构象改变，使其能够结合到pTRE3G启动子上启动SNCA的表达，实现时间和空间上的诱导表达。采用盐酸四环素灌胃，几乎不通过血脑屏障的原理来诱导SNCA小鼠肠道内致病蛋白的表达，使SNCA小鼠的行为学表型与典型帕金森病的动物行为类似。由于SNCA小鼠的构建来源于基因修饰小鼠的交配，因而可以保证模型小鼠的数量以及各实验批次间的重复性和实验结果的稳定性。由于SNCA小鼠模型能在背景小鼠中条件性诱导带有荧光标签的致病蛋白表达，因而能在避免高本底值的α‑Syn干扰的同时，可动态分析聚集体的传播路径及脑内的传播方式，为探索肠道源性帕金森病的发病机制及神经环路，并为早期诊断帕金森病提供新的模型基础。附图说明

[0022] 图1为采用CRISPR/Cas9技术将pTRE3G‑SNCA‑P2A‑RFP‑Sox10MCS4‑CFOS‑rtTA3G基因片段定点插入到小鼠的Rosa26位点的示意图；

[0023] 图2为donor载体的质粒图；

[0024] 图3为利用PCR法鉴定阳性过表达小鼠基因型核酸电泳结果例图；其中，A为插入基因上游引物的PCR结果图，B为插入基因下游引物的PCR结果图，C为WT的PCR结果图，D为marker；

[0025] 图4为免疫荧光染色检测SNCA小鼠的肠道致病蛋白的聚集体的结果图；

[0026] 图5为免疫荧光染色检测转基因小鼠的脑内蛋白聚集体的结果图，标尺＝50μm；

[0027] 图6为转棒评价SNCA小鼠的基本运动功能结果图；

[0028] 图7为新物体识别及水迷宫实验评价SNCA小鼠的认知行为结果图；其中，A为小鼠水迷宫学习情况，纵轴表示学习四天时间后4M‑SNCA小鼠与对照组小鼠找到平台时间的比较结果图；B为小鼠水迷宫空间记忆行为的测试，纵轴表示第五天小鼠在目标象限所处的时间(time)与对照组的比较结果图；C为小鼠新物体识别实验，纵轴表示新物体识别指数(RI＝(小鼠在新物体处的时间‑小鼠在旧物体处的时间)/(小鼠在新物体处的时间+小鼠在旧物体处的时间)×100％)。

具体实施方式

[0029] 本发明提供了一种“肠‑脑轴”帕金森病小鼠模型的构建方法，首先构建SNCA小鼠模型并鉴定，然后用组织学方法分析鉴定SNCA小鼠的肠道及脑内致病蛋白聚集体的相关表型，最后用行为学实验方法验证分析SNCA小鼠出现的帕金森病行为学表型。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

[0030] 一、条件性过表达基因敲除小鼠的获取与鉴定

[0031] 1.donor载体的构建

[0032] 1)获取人源SNCA基因

[0033] 在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6622查询人源SNCA基因。转录本MGI(ENSG00000145335)。

[0034] 2)扩增

[0035] 以人源SNCA基因cDNA为模板，设计引物SNCA‑F和SNCA‑R，序列如表1中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，PCR法扩增SNCA片段，得到SNCA cDNA。

[0036] 以P2A(序列如表1中SEQ ID NO.3所示)为模板，设计引物P2A‑F和P2A‑R，序列如表1中SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，PCR法扩增P2A片段，得到P2A。

[0037] 以RFP(序列如表1中SEQ ID NO.6所示)为模板，设计引物RFP‑F和RFP‑R，序列如表1中SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，PCR法扩增RFP片段，在长链引物后面添加polyA尾序列，得到RFP‑polyA。

[0038] 3)连接SNCA cDNA、P2A和RFP‑polyA

[0039] 以pTRE3G常规质粒为模板，设计引物pTRE3G‑F和pTRE3G‑R，序列如表1中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示，PCR法扩增pTRE3G片段，得到pTRE3G。

[0040] 使用infusion试剂盒(In‑Fusion HD Cloning kits，购自TAKARA，Clontech639648)将步骤2)得到的SNCA cDNA、P2A和RFP‑polyA连接到四环素依赖诱导表达载体pTRE3G上，得到pTRE3G‑SNCA‑P2A‑RFP。并测序验证，确保序列不存在碱基突变。

[0041] 4)连接

[0042] 分别以rtTA3G、human CFOS启动子和Sox10MCS4增强子常规质粒骨架为模板，PCR法克隆每个片段，将克隆得到的片段连接在一起，得到Sox10MCS4‑CFOS‑rtTA3G；

[0043] 其中，infusion引物rtTA3G‑F和rtTA3G‑R的序列如表1中SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。

[0044] 5)连接SNCA‑P2A‑RFP‑rtTA3G‑hCFOS‑Sox10MCS4 final

[0045] 将步骤4)得到的Sox10MCS4‑CFOS‑rtTA3G连接到步骤3)得到的pTRE3G‑SNCA‑P2A‑RFP载体上，得到donor载体，质粒图谱如图2所示。

[0047]

[0048]

[0049] 6)根据碱基序列设计引物donor‑F和donor‑R，序列如表1中的SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示，再以步骤5)合成好的donor载体为模板，按照表2中的PCR反应体系和反应条件进行PCR，将PCR产物经过琼脂糖凝胶纯化回收后，测定其浓度，得到donor DNA，用于后续显微注射。

[0050] 表2反应体系和反应条件

[0051]

[0052] 2.gRNA的构建

[0053] 使用麻省理工学院的CRISPR Design工具(http://crispr.mit.edu/)，依据Score的高低设计一对长度为20bp的针对靶标DNA的寡聚核苷酸链序列用于制备gRNA，序列如表1中的SEQ ID NO.15所示。将合成后的2条单链寡聚核苷酸gRNA序列退火(95℃，5min后自然降至室温)形成双链DNA，构建gRNA表达载体。将gRNA的表达载体线性化，经酚氯仿抽提纯化后，作为模板用于体外转录，并依照MEGAshortscript Kit(Thermo Fisher,AM1354)试剂盒体外合成gRNA。

[0054] 3.体外Cas9蛋白酶切活性检测

[0055] 按照Cas9蛋白酶切活性试剂盒(购于北京英茂盛业，PC1400)说明，配置表3所示的反应体系，反应条件为37℃15min，从而检测Cas9蛋白的酶切活性。

[0056] 表3反应体系

[0057]

[0058] 4.转基因载体原核显微注射

[0059] 应用显微注射的方法将上述Cas9蛋白、纯化后的donor载体和gRNA注入到C57BL/6JGpt小鼠受精卵的原核中，使其与小鼠基因组整合，再进行品系基因鉴定，最终建立基因组中带有外源基因SNCA的小鼠模型，出生的首代转基因阳性的小鼠即为founder小鼠；对每个founder都进行PCR鉴定。步骤如下：

[0060] 1)按照表4配制显微注射组分，将配制好的组分4℃高速离心，10min后取出15μL，用于后续显微注射实验。

[0061] 表4注射浓度及体积

[0062] 组分浓度体积Cas9蛋白 100g/μL lμL
Htt‑L3 gRNA 20ng/μL lμL
Htt‑R3gRNA 20ng/μL lμL
Donor DNA 50ng/μL 8μL
Add RNase‑free H2O to 20μL

[0063] 2)对6周龄C57BL/6JGpt雌鼠(供体小鼠)进行HCG诱导后，与雄鼠同笼交配，将有阴栓的雌鼠进行安乐死，取输卵管，分离受精卵，并进行体外培养。使用显微注射仪将15μL步骤1)配置好的显微注射组分注入供体小鼠的受精卵的原核中，使其与供体小鼠基因组整合，随着细胞不断分裂，每个细胞将携带该片段。

[0064] 3)将步骤2)得到的受精卵移植到假孕的C57BL/6JGpt雌鼠(受体小鼠)子宫中，等待F0代小鼠出生，对F0代小鼠的出生日期、出生只数、性别等进行记录，用耳标对其进行标记。待基因型正确的F0代小鼠性成熟后，与野生型C57小鼠交配，繁殖得到子代小鼠，即founder小鼠。

[0065] 5.条件性过表达基因敲除小鼠的基因鉴定

[0066] 1)DNA样品制作：剪取F1代founder小鼠脚趾1～2mm，并对脚趾进行编号，放入EP管中，加入180μL消化液(0.1mol Tris‑HCl PH值＝8.5；5mmol EDTA；0.2％ SDS；0.2M NaCl)，加入蛋白酶K10μL，56℃水浴过夜。

[0067] 同时，以WT小鼠作为对照，其他实验条件相同。

[0068] 2)将步骤1)水浴过夜后的溶液在，21℃条件下以12000rmp的速度离心10min，液体上下分层后，将上清吸出放入另一个EP管，移液时不要吸到杂质。加入1mL无水乙醇/异丙醇，在21℃条件下以12000rmp的速度离心10min，弃上清液，管底为白色透明沉淀。清洗DNA，加入1mL 75％乙醇(最好现配、超纯水)，清洗，倒掉75％乙醇，EP管倒立晾干。最后，在晾干的EP管中加入50～100μL dH2O(超纯水)，37℃，15min水浴室温溶解DNA。

[0069] 3)按照表5混合20μL体系，加入PCR管，PCR反应所用引物如表6中的SEQ ID NO.16～SEQ ID NO.21所示：

[0070] 表5PCR反应体系

[0071]

[0072] 表6PCR引物

[0073]

[0074] 4)两步法PCR扩充：预变性95℃，5mins；扩增98℃，30s；退火65℃，30s，重复20个循环；延伸72℃，4min；终止保存于4℃。

[0075] 5)PCR产物的电泳分离与观察：利用1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，并以DNA marker指示扩增条带大小和位置。在凝胶成像仪中采图，得出基因型鉴定结果，如图3所示，目的条带分别是1500bp(插入基因条带)和400～500bp(WT)。根据PCR策略示意图，经PCR和测序确认，1#，4#，7#，8#，13#，15#，17#小鼠为阳性小鼠。

[0076] 二、“肠‑脑轴”帕金森病小鼠模型的构建

[0077] 采用10mg/mL的盐酸四环素对2月龄的founder小鼠模型进行为期8周的灌胃，停止灌胃后继续饲养小鼠2个月以上，以使肠道诱导表达蛋白聚集形成致病聚集体，并出现脑内播散，得到“肠‑脑轴”帕金森病动物模型，即：SNCA小鼠。

[0078] 三、组织学方法鉴定SNCA小鼠肠道及脑内致病蛋白的聚集

[0079] 对2月龄灌胃8周后继续饲养至12月龄的SNCA小鼠进行肠道组织及脑组织进行免疫荧光染色，判断肠道神经丛内的致病蛋白聚集情况及脑内播散情况，2月龄SNCA小鼠灌胃8周后肠道会出现致病蛋白聚集体；2月龄SNCA小鼠灌胃8周后继续饲养2月后，逐渐出现脑内致病蛋白聚集体。具体如下：

[0080] 以未灌胃的SNCA小鼠作为对照组，以2月龄灌胃8周后继续饲养至12月龄的SNCA小鼠作为12M‑SNCA。将各组小鼠经多聚甲醛灌注固定，取出脑组织以及全部肠道，将肠道内容物进行清理，分别取胃下1cm作为空肠，盲肠上1cm作为回肠，盲肠下1cm作为结肠，将取出的脑组织及肠道组织分别放入4％ PFA中，4℃冰箱浸泡过夜进行后固定，随后更换为30％蔗糖溶液4℃脱水48h以上，待组织完全沉底即可进行冰冻切片制备，获得厚度为20μm的脑组织及横切面的肠道切片。

[0081] 采用α‑Syn N103(α‑突触核蛋白的标记物)与红色荧光蛋白(RFP)对肠道切片进行免疫荧光双标染色。采用A‑α‑Syn N103蛋白(α‑突触核蛋白聚集体的标记物)与TH(多巴胺能神经元细胞标记物)对大脑切片进行免疫荧光双标染色。染色前为防止切片从载玻片上脱落，用4％ PFA室温固定切片30min，PBS清洗3×10min；以封闭液(3％ BSA+0.3％ Triton)湿盒中室温孵育切片1小时；加入封闭液配置的一抗(酪氨酸羟化酶，TH，多克隆抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；α‑突触核蛋白聚集体，A‑α‑SynN103，多克隆抗体购自美国millipore公司；红色荧光蛋白，RFP，多克隆抗体购自美国Gene Tex公司，α‑突触核蛋白，α‑Syn N103，单克隆抗体于武汉金开瑞生物工程有限公司合成)，湿盒中室温孵育过夜；次日PBS清洗3×10min，加入二抗(Alexa 594标记驴抗小鼠多克隆二抗、Alexa 647标记的驴抗兔多克隆二抗购自美国cell signaling公司)，室温孵育2h，PBS洗3×10min；DAPI(4',6‑二脒基‑2‑苯基(4',6‑diamidino‑2‑phenylindole，DAPI)购自德国Sigma公司)衬染核5min，50％甘油封片；激光共聚焦显微镜观察并进行图像采集。

[0082] 肠道切片染色结果如图4所示，α‑Syn蛋白带有红色荧光蛋白，且肠道神经元内出现了α‑Syn蛋白的聚集体，说明SNCA小鼠模型构建成功。

[0083] 脑内蛋白聚集体的染色结果如图5所示，出现两者共标，表明SNCA小鼠脑内出现了α‑Syn蛋白聚集体，SNCA小鼠模型构建成功。

[0084] 四、行为学方法验证SNCA小鼠出现帕金森病的行为学表型

[0085] 根据帕金森病模型常用的行为学评价方法，采用转棒、新物体识别以及水迷宫实验评价SNCA小鼠的基本运动功能和认知水平。具体步骤如下：

[0086] 以2月龄灌胃8周后的4月龄SNCA小鼠作为4M‑SNCA，以同月龄的未灌胃的SNCA小鼠作为对照组。

[0087] 针对小鼠运动行为评价，采用转棒实验进行评估，转棒实验步骤：共分为学习阶段和测试阶段两个阶段三天，前两天为第一个阶段，为学习阶段，最后一天为测试阶段。第一天：设置好转速并接通电源后轮子可自动转动，该转动棒在5分钟的时间内逐渐将旋转速度从0rpm增加到10rpm。若中途小鼠掉落，将小鼠重新放回装置继续进行训练，进行三个连续试验，每次实验为5分钟。每个试验之间的休息时间为30分钟。第二天：设置好转速并接通电源后轮子可自动转动，该转动棒在5分钟的时间内逐渐将旋转速度从4rpm增加到40rpm。若中途小鼠掉落，将小鼠重新放回装置继续进行训练，进行三个连续试验，每次实验为5分钟。每个试验之间的休息时间为30分钟。第三天：设置好转速并接通电源后轮子可自动转动，该转动棒在5分钟的时间内逐渐将旋转速度从4rpm增加到40rpm。记录小鼠掉落的时间，不放回小鼠，进行三个连续试验，每次实验为5分钟。每个试验之间的休息时间为30分钟。

[0088] 转棒实验结果如图6所示，转棒实验中4M‑SNCA小鼠延迟掉落时间显著低于对照组的4月龄小鼠，说明SNCA模型小鼠出现了运动功能障碍。

[0089] 帕金森病人晚期亦会出现认知功能下降，然而大多数帕金森动物模型不能模拟认知障碍这一表现，本模型对小鼠的认知功能亦进行了评价。

[0090] Morris水迷宫步骤：水迷宫实验开始前准备一个直径120cm的水池，一个直径10cm的平台，注入清水至没过平台，在水中加入增白剂。实验共进行5d。1～4d为定位航行实验，水池被划分为四个象限，在第四象限放置平台，让小鼠游泳1min，1min内成功寻到平台则结束实验，若小鼠未找到平台，则引导小鼠到平台位置记忆5～7s。每只实验小鼠从四个象限分别放入1次，录像记录，重复4d。最后一日为空间探索试验，实验当天去掉平台，将每只小鼠分别从水池四个象限边缘放入1次，使实验小鼠游泳1min，录像记录，用软件统计数据。

[0091] 新物体识别实验步骤：该实验分为2天进行，在进行测试或训练前2小时，将小鼠放在测试的房间内，适应测试环境。第一天：将小鼠放入场地内适应10min，第二天开始训练，将A、B两个相同物体放在一侧壁的对角两端，小鼠鼠背朝两物体放入场地内，并且小鼠鼻尖距离两物的长度要一致。小鼠放入10min，放入后立即开启录像设备，记录小鼠与这两个物体接触的情况，包括鼻子或嘴巴触及物体的次数和距离物体2～3cm范围内探究的时间(前爪搭在物体上、鼻子嗅物体、舔物体等均属探究物体，摆个架势或爬到物体上不动不能算是对新物体的探究)。10min结束后，立即将小鼠放回原来饲养的鼠盒内，待小鼠休息6小时后再进行测试(此期间小鼠仍待在测试房间内)。待小鼠休息6小时后开始测试，这时将场地内的B物体换作C物体(与AB物体不同)，仍将小鼠背向两物体，鼻尖据两物体距离相同，同样用录像设备录像，采用smart系统对小鼠行为进行分析，最终计算出新物体识别指数(RI＝(新物体‑旧物体)/(新物体+旧物体)×100％)。

[0092] 统计学方法：采用Two‑way ANOVA进行统计学分析。

[0093] 针对小鼠的认知功能评价，选择Morris水迷宫和新物体识别实验，实验组小鼠表现出空间记忆能力的降低。结果如图7，图7中A显示在水迷宫实验中对小鼠进行前4天的训练期间，4M‑SNCA小鼠与对照组小鼠找到平台时间相比有显著差异，提示SNCA小鼠出现了学习障碍，第五天的测试阶段，撤去平台后，4M‑SNCA小鼠在目标象限所处时间(图中B)明显少于对照组的4月龄小鼠，说明SNCA模型小鼠出现了空间记忆下降的趋势。图7中C显示4M‑SNCA小鼠在新物体识别实验中表现出新物体识别指数下降，提示SNCA模型小鼠出现了认知功能障碍。

[0094] 以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。