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脑声课堂丨啮齿动物阿尔茨海默症模型及常用行为学方法评价

来源：萌宠菠菠乐园时间：2024-09-15 06:54

AD 是一种由多病因引起且病理学极其复杂的疾病。实验动物模型不管是对 AD发病机制的研究还是对药物的开发都非常重要动物模型如今已经成为理解 AD机制的重要工具。动物模型的主要要求是尽可能准确地再现人类的病理生理学。AD啮齿动物模型主要进行认知行为测试，用于评价动物认知缺陷状况。其次还可运用不同行为范式评估AD动物的运动，日常行为，社交以及情绪变化等。

阿尔茨海默症小鼠模型的建立

用于研究AD的动物模型可分为自然模型（natural models）、遗传修饰模型（genetically modified models）和诱导模型（induced models）三类。失忆是衰老最初的普遍现象。因此，老年动物可能被用作痴呆和记忆丧失障碍的自然模型。老年啮齿动物（包括大鼠和小鼠等）通常不会自发地表现出AD样病理学特征。一些物种（譬如犬和非人灵长类）的老年表现与人类的AD特性更为相似。由于自然模型不需要任何人工操作，是模拟AD自然病理生理学过程的宝贵工具。快速衰老的SAMP8品系小鼠是研究AD的理想模型。该品系小鼠不但表现出年龄相关的学习记忆障碍，而且表现出AD发病机制的大部分特征。

此外，AD诱导模型可以分为化学诱导模型和损伤诱导模型。可以经脑部注入特定的物质影响神经递质途径，阻滞神经元，导致动物痴呆，从而建立化学诱导模型，例如Aβ或东莨菪碱诱导的遗忘模型。通过外科手段在侧脑室或脑实质内注射微量神经毒物质（如NMDA、鹅膏蕈氨酸和胆碱毒素AF64）引起脑部病变，可建立损伤诱导模型，该模型有助于了解胆碱能神经支配在认知功能障碍中的作用机制。将Aβ1-42注射于雄性C57BL/6小鼠脑双侧海马构建AD小鼠模型。造模时，以 10 mL/Kg 的剂量腹腔注射 4%水合氯醛麻醉小鼠，然后将小鼠固定于脑立体定位仪上，用钻孔针在前囟后2 mm，矢状缝旁±2.5 mm处钻一小孔，以定位海马区。用注射器在颅骨下2 mm深度以1 μL/min的速度注射2.5 μL的200 μmol/L的Aβ1-42 溶液，注射完后，留针 5 min，避免溶液回流，小鼠左右两侧海马均注射。完成后，继续于SPF动物中心饲养3天。假手术组小鼠两侧海马注射同等剂量的生理盐水。

三类阿尔茨海默病动物模型的优缺点

评估AD动物空间参考记忆和工作记忆

1水迷宫定位航行试验

（1）小鼠水迷宫泳池直径为120 cm，在池壁上标记四个等距离点S、W、N、E作为试验起点，将水池分为四个象限。然后，把平台放置于其中一个象限中央，加入适量清水，并加入钛白粉，使水溶液底色呈白色，然后调节水温为23±2℃。每次试验前将小鼠置于试验房间适应环境30 min。

（2）第一天，将水的高度调节至平台下1 cm，使平台可见。将小鼠从不同的象限放入水池中，记录其游上平台的时间，若180 s内未游上平台，则用木棍引导至平台休息30 s，熟悉周边环境后取下小鼠，擦干后放回笼中。

（3）从第二天开始，将水的高度调节至平台以上1 cm，隐匿平台。将小鼠从四个象限分次放入水池中，记录小鼠游上平台的时间，若180 s内未游上平台，则用木棍引导至平台，并休息30 s，熟悉周边环境后取下小鼠，擦干后放回笼中。每天上、下午各训练一次，连续训练3天。

2空间探索试验

定位航行试验完成后，次日进行空间探索试验。将水池中的平台撤掉，任选一象限作为入水点，记录小鼠在 60 s 内的游泳路径和目标象限的停留时间。

（A）逃逸潜伏期；（B）游泳路程；（C）运动轨迹图；（D）目标象限停留时间；Sham，假手术组；

3Morris水迷宫

Morris水迷宫记录大鼠由2 个不同的象限找到平台所需要的时间即潜伏期, 潜伏期越长则空间辨别能力越差。Aβ1~40注射组大鼠的潜伏期较盐水注射组明显延长。根据在水箱外部学习到的视觉线索，测定大鼠或小鼠在装有不透明液体的圆形水箱中找到稳定平台的能力。找到这些平台所需的时间是衡量认知功能的主要指标。该模型是检测海马空间记忆缺陷最常见的行为测试方法之一。

4放射臂迷宫（Radial arm maze，检测空间工作记忆）

有6～8条手臂从中心空间放射出来的迷宫。其中一只手臂含有动物找到后可以得到的奖励食物。

5巴恩斯迷宫实验（Barnes maze）

圆形桌子边缘最多有20个圆孔，每个圆孔都有视觉提示，其中一个下方有一个“逃生箱”，啮齿动物可以通过桌面上相应的孔进入。由于啮齿动物对开放空间厌恶，此模型可以促使动物寻找逃生箱。

6Y 迷宫（检测空间近期记忆）

Y 迷宫由3个相同的臂以120°的角度相互连接组成，从一个中央平台向外辐射。将小鼠放置在一只手臂的末端，并在 5 min 内自由接触所有手臂，记录 5 min 内每只小鼠在各个臂的穿梭次数。小鼠进入每个臂的标准为四肢完全进入。小鼠依次进入 3 个不同臂是一个正确的交替；而每次探索中有 2 个臂未进入时，则为 1 个错误的交替。计算正确交替百分比：正确交替百分比=正确交替数/总交替数× 100%。

7避暗实验

避暗实验又称被动躲避实验, 是根据动物趋暗避明的天性设计而成的行为学实验, 是除水迷宫之外另外一种评价动物认知能力的经典方法。该实验基本原理是给予动物电击等厌恶型刺激, 动物必须在训练中形成记忆, 克服天性并采取被动躲避的方法, 才能避免受到伤害。避暗实验的实验装置由大小相同的明暗箱、穿梭门、电栅和电刺激器组成。其中明暗箱和穿梭门的尺寸因动物大小而异, 箱体长宽多在15~30 cm之间, 暗箱底面由直径为3~5 mm的不锈钢电栅组成, 其间隔多为1~1.5 cm, 可供动物脚掌同时跨列站立。避暗实验分为适应期、训练期和测试期3个阶段。适应期的目的是让动物熟悉明暗箱环境, 将动物从明箱放入, 5~10 s之后穿梭门打开, 让动物在明暗箱之间自由穿梭探索3~5 min。适应期结束30 min后进入训练期, 此时将动物再次放入明箱, 当动物出于天性进入暗箱之后, 穿梭门关闭, 同时电栅通电, 给予动物一定强度的电流刺激。持续大约20 s后, 将动物从暗箱中取出, 放回至笼中饲养。训练期结束24 h之后进入测试期。测试期通常持续5 min, 此时将动物再次放入明箱, 5~10 s之后穿梭门开启, 记录动物的步入潜伏期(第1次进入暗箱的时间)、进入暗箱的穿梭次数和在暗箱中停留时间, 以供后续分析。

检测模型小鼠日常活动能力

1筑巢行为实验

实验前将单只小鼠分笼饲养，使其适应环境至少24h。在小鼠新的饲养笼（25×15×14cm3）中放入约2cm厚的新垫料，将6块正方形软纸片（4cm×4cm）均匀平铺于垫料上，作为小鼠筑巢材料。将小鼠放入笼内，饮食照常供应。筑巢实验时间为当天19：00至次日7：00，AD小鼠的筑巢能力降低。

2刻板行为

将测试动物单独放置在一个80ｘ80厘米的开放箱体中，使其自由活动20分钟，测量后10分钟内动物自我梳理的总时间和总次数，自我梳理的特征包括：舔爪子、洗鼻子和脸或者用爪子抓毛。

评估AD动物联想学习

1场景恐惧实验（Cued and contextual fear conditioning）

将一个特定的无倾向性的条件刺激与一个厌恶的无条件刺激联系起来，让动物表现出条件反应。具体操作如下：啮齿动物被放置在一个调节室中，给予条件刺激（听觉线索）和厌恶的非条件刺激（电击）；休息一段时间后，动物暴露在同一个调节室和一个不同形状的环境空间中，出现听觉线索，观察动物出现冻结行为的情况。冻结行为是一种常见的对恐惧情境的反应，可以作为恐惧记忆的衡量指标。

- 条件性恐惧实验系统，型号：XR-XC404,上海欣软 -

评估AD动物识别记忆

1新物体识别（new object recognition，NOR）

利用啮齿动物自发倾向于探索新物体的本能而建立模型。啮齿动物放置在测试空间探索并适应24 h后，在空间内等距放置两个相同的物体。第2天，这些动物被放在开阔的场地里，面对熟悉的物体和新奇的物体（高度和体积一致，但形状和外观不同），测试它们的长期识别记忆能力测试仪器由一个黑色有机玻璃盒子组成，放置在光线昏暗的测试室内。测试中使用 A、B、C 3 个物体，其中 A、B 一样，C 与 A、B 不同。小鼠在装置内（无物体）自由运动10 min。再放入 A、B 2个物体，A、B均无气味且固定，距离两侧壁约10 cm。将小鼠背朝物体从距物体等距离处放入装置中，记录小鼠在 3 min 内探索每个物体的时间（用鼻子在1 cm半径内嗅探物体和/或触摸物体）。间隔24 h后将A、B 其中一个替换成C，以同样的方式将小鼠放入装置中 3 min。记录小鼠在 3 min 内探索每个物体的时间。计算区分新物体和熟悉物体的辨别指数（discrimination index，DI）：DI=（探索新物体的时间−探索熟悉物体的时间）（探索新物体的时间 / +熟悉物体的时间）×100%。

神经精神症状如抑郁、冷漠、攻击性和精神分裂症等现在被认为是AD的一大重要特征，并且普遍认为，更严重的症状很可能预示着更快的认知衰退，独立性丧失，甚至更短的生存期，因此可进行AD动物情绪评估测试。

评估AD动物情绪实验

1旷场实验

旷场实验的优点是快速且易于进行，无需事先对动物进行训练，其实验过程内的各种结果，如中心时间、活动距离和排便，可以衡量焦虑等情绪。流程如下：

1) 向底面为方块形的动物专用运动测试盒内放入一只待测小鼠。每次放置确保箱体内背景颜色、气味、形状等环境特征保持每天每次测试恒定不变。

2) 单次测试时间为 30 分钟。通过测试箱体上方附带的红外摄像头可以对小鼠躯体位置进行多点定位跟踪以达到可视化目的，在 protocol 中将区域设置为相同的小正方形，通过计算实验期间动物穿过的线或正方形的数量，从而精确显示运动活动。

3) 小鼠单次试验检测结束后轻轻取出放回笼盒，并用 20%的酒精对测试箱底面和侧壁进行喷洒以去除上一次实验过程中产生的气味痕迹，如粪便、体味。

4) 待所有小鼠均完成旷场实验后，运用相关对应软件对实验结果进行处理统计。

2明暗箱实验（光/暗测试）

明暗箱实验（光/暗测试）是基于啮齿类动物天生对明亮照明区域的厌恶，以及啮齿类动物对轻度压力源（即新环境和光）的自发探索行为，根据文献中常报道的经典行为学范式制定，具体步骤如下：

1) 明暗箱在整个大装置内设置了光照强度不同的两部分箱体，左侧箱体始终维持黑暗, 右侧箱体始终维持光照，两箱体尺寸均为长 30 cm，宽 15 cm，高40 cm，且两箱体之间通过一较小开口连接，方便小鼠可自由进出。

2) 单次测试时间为 30 分钟。首先将待测小鼠从明箱处自由放入，由其自主活动至试验结束后，此过程中小鼠躯体位置由箱体上方附带的红外摄像头进行追踪。最后记录小鼠分别在明箱和暗箱的活动距离、总时间以及两箱体间穿梭次数。

3) 小鼠试验检测结束后取出轻轻放回笼盒，避免力度过大而过度应激，用 20%的酒精对测试箱底面及侧壁进行喷洒以去除上次实验过程中产生的气味痕迹。

4) 待所有小鼠均结束明暗箱测试后，运用相关对应软件对实验结果进行处理统计。

3高架十字迷宫实验

高架十字迷宫实验是一种常见且最简单的用于评估与啮齿类动物焦虑症相关的行为测试。该测试有助于快速筛选调节焦虑状态的药物或焦虑易感鼠系，而不涉及复杂的时间流程或训练。与其他使用食物或水剥夺或电击来评估焦虑的模型或行为测试相比，它更具有自然条件下的优势。具体步骤如下：

1) 高架十字迷宫，即所用装置为一个高于地面 50cm 的十字形迷宫，由两个开放臂、两个闭合臂和一个中央方形区域，两臂尺寸为长 50cm、宽 10cm，方形区域尺寸为长、宽各 10cm，闭臂各侧面由 15 cm 高的墙面遮挡，开臂除底面外无任何遮挡，整个装置中所有墙面材料均由相同颜色材料组成。

2) 试验开始时，向中央方形区域轻轻放入一只小鼠，任其自由探索整个装置5分钟。由箱体上方的红外成像装置对小鼠运动位置进行实时可视化录像定位。

3) 待测试完成后把待测小鼠轻轻放回原笼盒，向整个测试箱内环境进行酒精喷洒处理，以去除上次试验中产生的气味痕迹。

4) 待所有小鼠均结束实验后，使用相关对应软件对实验结果进行统计处理。

小鼠高架十字迷宫，型号：XR-XG201，上海欣软

4强迫游泳实验

强迫游泳试验（FST），也称为行为绝望试验，作为预测抗抑郁药物临床疗效的行为模型之一。不动时间以及到初始不动期的延迟是主要的相关度量指标。

1) 将动物放在一个装有25°C水、水深15cm左右的透明圆柱体中（材质为有机玻璃），要求水深较深以保证它们无法逃离，水温较适宜以避免对小鼠产生其他不良刺激。

2) 试验开始时，将待测小鼠缓慢倾斜放入液面中，每次试验时间为 6 分钟，前 2 分钟被认为是适应期，统计后 4 分钟内的不动时间。典型不动姿势的特点是漂浮在水中，只需要保持鼻子高于水面，前爪微动以保持平衡等动作。每次试验结束时，将圆柱体内的水更换成条件适宜的新鲜用水。

3) 最后根据视频对 6min 内后 4min 内的静止不动时间进行统计处理。

5悬尾实验

悬尾实验（TST）用于测量抗抑郁药物的潜在有效性，与强迫游泳实验具有共同的理论基础和行为度量，但因小鼠在水性任务中往往表现更差，故与 FST 相比往往有一定优势。

1) 实验装置为单侧开口箱，各箱面背景均为白色，箱顶有一个感应装置，感应器下方连有一金属钩，实验前使用透明胶带将待测小鼠的尾巴粘在在水平金属钩上，注意胶带距离尾部末端不可太近或太远，一般1cm处较合适，目的是避免出现小鼠爬至金属钩上方造成实验失败。单次试验时间设置为6分钟，并设定好检测小鼠动与静止不动的阈值。通过Tail suspension软件记录位于不动阈值下的时间；

2) 每次实验结束后，用酒精喷洒金属钩附近及正下方台面，并用纸清理毛发及粪便；

3) 通常，悬挂的啮齿类动物会立即进行几次激动或类似逃跑的行为，随后会暂时保持不动的姿势，故所有试验前2分钟被看作是适应期，应统计所有小鼠后4分钟内的静止不动时间。

评估AD动物社交行为

1三箱社交实验

三箱社交实验来检测啮齿类动物的社交行为障碍。实验设备分为左、中、右三箱,首先,分别在左箱和右箱放置空笼1和2。实验小鼠在装置中自由探索10 min,以充分熟悉设备环境。第一阶段,在左箱中的笼1中放入陌生小鼠1(stranger1, S1),实验小鼠继续在三箱设备中探索10 min。第二阶段,向右箱中的笼2放入陌生小鼠2(stranger2, S2)。记录实验小鼠在三箱设备中探索10 min内的运动路程、与S1和S2分别接触的时间。在陌生小鼠附近花费较少时间的动物被认为具有类似抑郁的症状，因此可通过检测动物的社交偏好指数。

野生型小鼠与5xFAD小鼠的社交新奇性行为轨迹图 S1：陌生小鼠1;图S2：陌生小鼠2

评估AD动物运动能力

1转棒实验

转棒实验是一种常用的行为学实验，用于评估小鼠的协调运动和平衡能力。实验通过让小鼠站在一个旋转棒上，观察小鼠在不同速度、不同角度和不同时间的旋转棒上的表现，以评估其运动和平衡能力，记录每只动物在轴上保持不落的时间。

2圆筒实验

圆筒试验主要针对不对称中枢神经系统疾病，如帕金森病、阿尔茨海默病、脑卒中等，研究动物在贴壁站立过程中前肢的对称性和使用率。圆筒的形状能够刺激鼠用前肢垂直探索筒壁，记录鼠后肢站立时前肢最初触及筒壁的次数，并分别记录左、右侧触及和双侧触及的次数。

3自主转轮运动与跑台运动

运动对阿尔茨海默症动物模型影响的研究主要采用2种运动模式：自主转轮运动（自主运动）与跑台运动（强迫运动）。跑台运动被为是典型的强迫运动，而这种运动形式被证明会增加啮齿类动物应激反应，应激压力可能会加重小鼠模型的阿尔茨海默症病理过程。

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动物行为实验必看